Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 172
Текст из файла (страница 172)
Это позволило бы лучше контролировать реакцию. Данная идея несколько утратила свою обоснованность ввиду того, что была продемонстрирована способность нуклеосом к реконструкции, по крайней мере ш рйго, с немодифицнрованными гистонами (но см. гл. 29). Недолговечность ацетилированного сос юяния оказалась препятствием для его изучения. Однако зто препятствие можно преодолеть, добавляя масляную кислоту к клеткам, растущим в культуре.
При этом ингибируется фермент гистон-деацетнлаза и ацез.илированные нуклеосомы накапливаются. Все гистоны сердцевины ацетилированы. При ацетилировании в хроматине происходят изменения, подобные тем, которые наблюдаются при активации гена.
Такой хроматин более чувствителен к ДНКазе 1 и (возможно) к нуклеазе микрококков. Одна- 30. Нуклеосомы в активном хроматнне 385 Образование дочерних ядер Начало клеточного цикла Начало митоза лнцир сны рбаань ге щу уб ег 25 — ! Ю2 Рис. 30.10 В период синтеза ДНК происходит ацетилироаание гистонов сердцевины с последующим деацилироаанием. Основ- ко каких-либо убедительных корреляций обнаружить не удалось, преимущественного ацетнлнровання активных генов не обнаружено. Из этого можно сделать вывод, что ацетнлнрованне действительно затрагивает структуру хрома!пни.
Однако значение этого изменения еще неясно. Цикл фосфорилнровання и дефосфорнлирования обнаружен у гнстона Н1, однако по времени он отличается от цикла модификации других гистонов. В культуре клеток млекопитающих одна илн две фосфатные группы могут быть введены в фазе 8. Но основное фосфорилнрованне происходит позднее, когда добавляется еще несколько фосфатных групп, так чтобы общее нх число достигло шести.
Как показано на рнс. 30.!О, это происходит в миюзе. Все фосфатные группы удаляются в конце процесса деления. Введение некоторых фосфатных групп катализируется ферментом фосфокнназой, активность которой резко возрастает в самом начале митоза. О фосфатазе, под действием которой позднее происходит удаление фосфатных групп, известно немного.
Время основного фосфорилировання гнстона Н! навело на мысль о том, что он может участвовать в митотнческой конденсации хромосом. Это согласуется с даннымн о необходимости гистона Н! для образования нитей хроматнна размером 30 нм (гл. 29), Некоторые температурочувствнтельные мутанты, дефектные по Н!-фосфорнлнрованню, не способны закончить реплнкацню ДНК н завершить деление клетки. Но такая корреляция не говорит ничего о том, является ли фосфорнлнрованне причиной нлн сопутствующим событием мнтотической конденсации.
В некоторых нукдеосомах гистон Н2А связывается с убиквитином Необычная модификация гнстона была обнаружена при изучении белка, первоначально обнаруженного в негнстоновой фракции хроматнна печени крысы. Этот белок, известный сначала как А24, имеет ту же самую С- концевую аминокнслотную последовательность, что н Н2А. Однако, как изображено на рис. 30.11, у него две Н-концевые последовательности. Одна нз ннх принадле- нос фосфорилироаание тистона Н! происходит в начале митоза, а копне митоза пютон Н! дефосфорилируется. жнт гистону Н2А, а другая — белку убнквнтину. Название этого белка отражает его повсеместное (цЬ!г)ц!!оцз) присутствие в клетках-от бактерий до млекопитающих.
Конъюгат Н2А-убнквнтин теперь обозначают как (5Н2А. Белок убиквитнн состоит нз 76 остатков (сравннм с гистоном Н2А, содержащим примерно 130 остатков). Изопептидная связь образуется между С-концевым глнцнном убнквнтнна и свободной б-ХН2-группой лизина в положении 119 гистона Н2А. (Названием цзонеищиднал связь подчеркивается, что данная )~Н2-группа -это не обычная аминогруппа, участвующая в образовании пептидной связи.) Убнквнтнн-это кислый белок, в котором содержание глутамнновой н аспарагиновой кислот таково, что общее отношение основные/кислые аминокислоты во вновь образованном конъюгнрованном белке оказывается пониженным.
Около 5 — 15;; гнстона Н2А может находиться в форме 13Н2А. Обычно только одна из двух молекул Н2А в гнстоновом октамере связана с убиквнтином. Следовательно, убиквнтнн может присутствовать в 10 — 30% нуклеосом. Он находится, вероятно, на поверхности нуклеосомы. Довольно маленькая доля гнсгона Н2В также может соединяться с убнквнтнном.
Нуклеосомы, содержащие гистон Н2А, связанный с убнквитином, можно отделить от немодифицированных 2 з 11е 12е дч л — бе — щу — д е — — — — — — — ьут — — — — — — — ьу — ооон та ус~ ~ Мег Низ Рис. 30.11. !!Н2А состоит из убикаитина, связанного с Н2А. 386 Часть ЧП1.
Упаковка ДНК Ряс. 30.!2, Нуклеосомы, частицы минимальной нуклеосомы я частицы, связанные е убнквитяиом, можно разделить с помощью двумерного гель-электрофореза. нуклеосом с помощью двумерного электрофореза. Сначала нуклеосомы разделяют злектрофорстически на одной вертикальной дорожке. Затем электрофорез проводят под углом вправо к первоначальному направлению через всю пластинку геля. Соответствующие фракции отмечены иа рис. 30.12.
Здесь представлены нуклеосомы, содержащие около 170 п.н. ДНК и Н1 (фракция М)ч12), частицы минимальной нуклеосомы (фракция М)ч(!) и частицы минимальной нуклеосомы, содержащие один или два конъюгата 1?Н2А. Образуют ли частицы с Г?Н2А особый класс нуклеосом? Около 20'г„' нуклеосом в хроматине Гз. тв1ападаиег содержат 13Н2А. Их ДНК-последовательность можно исследовать методом блоттм ибридизации со специфическими зондами.
При использовании зондов, представляющих транскрибируемые гены, около 50% материала оказывается во фракции, содержащей убиквитин. При использовании в качестве зондов сателлитной ДНК во фракцию с убиквитнном попадает менее 4% исследованного препарата. Из этого следует, что Г)Н2А отсутствует в гстерохроматине. (Негистоновый белок обнаружен ишхько в нуклеосомах гетерохроматина ГЗ.
те(апоаавгег.) Конъюгат ГГН2А имеет тенденцию накапливаться в нуклеосомах трацскрибирусмых последовательностей. Функция убиквитина изучена очень плохо. По-видимому, он высвобождается из хроматина в митозе. Этот факт приводит в замешательство, поскольку возникает вопрос: каким образом убиквитннированное состояние определенных участков хроматина наследуется дочерними клетками? Недавно появились сообщения о возможной функции убиквитина в цитоплазме, где он принимает участие в системе деградации белков, Одна (или более) молекул убиквитина связывается с белком-мишенью в реакции, использующей АТР. Затем белок-мишень деградирует.
Следовательно, убиквитин служит маркером, используемым для идентификации субстрата системой деградации. Относится ли это и к событиям в ядре, не известно. Экспрессия гена связана С ДЕМЕТИЛИРОВаНИЕМ В ДНК животных клеток от 2 до 7",г С-остатков мстидированы (конкретное значение варьирует в зависимости от вида). Сателлитная ДНК часто бывает мстилирована очень сильно. Остальные мотальные группы разбросаны по всему геному, Большинство могильных групп найдено в дуплетах СО (СО-ОС), и действительно болыпинство СО-последоватедьностей может быть метилировано. Эта короткая последовательность представляет собой палиндром, н, как правило, нуклеотид С метилируется в обеих цеггях, образуя структуру: 5' СрО 3' 3' ОрС 5' Дуплет, который в отличие от этого метилирован только по одной из двух цепей, называют полуметилированным.
Распределение метндьных групп можно исследовать, используя рестрикт.ируюшие ферменты, которые расщепляют сайты-мишени, содержащие СО-дуплеты. На рис. 30.13 сопоставляются два фермента с рестриктирующей активностью. Это изосхизомеры, т.е. ферменты, которые расщепляют в качестве мишени одну и ту же последовательность ДНК, но по-разному реагируют иа ес метилированис. В этой парс фермент НраП расщепляет последовательность ССОО (записана последовательность только одной цепи ДНК). Но, если второй иуклеотид С метили- рован, фермент перестает узнавать этот сайт. Однако фермент Мвр1 расщепляет тот же самый сайт-мишень независимо от метилирования нуклеотида С.
Следовательно, фермент Мвр! можно использовать ддя идентификации всех ССОО-последовательностей, а НраП для того, чтобы определить, метилированы ли эти последовательности. Таким образом, если субстратом служит неметилированная ДНК, оба фермента образуют одни и те же рестрикционные полосы. Но если в ДНК имеются метилированные сайты, то расщепления по этим положениям под действием НраП происходить не будет. В каждом таком положении один большой фрагмент, образующийся под действием рестриктазы НраП, будет соозветствовать двум фрагменз ам, образующимся под действием рсстриктазы Мвр1. Такой пример показан на рис.
30.14. Инвариантна ли картина метилирования, или она меняется в зависимости от конкретных условий? Отдельные сайты были исследованы в нескольких случаях, в том числе в генах, кодирующих клеточный белок в тандемном кластере рДНК и в последовательности нескольких интегрированных или свободных вирусных геномов. Сайты, идентифицированные с использованием рестриктирующих ферментов,— это лишь некоторые из метилированных последовательностей, но мы полагаем, что их поведение типично для всех таких сайтов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
