Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 177
Текст из файла (страница 177)
Кроме того, необходимо ответить на вопрос, что именно узнается: двухцепочечная нуклеотидная последовательность или какая-то альтернативная вторичная структура. Очень важно иметь представление и о том, с помощью какого механизма регуляторным белкам удается инициировать только один цикл репликации на каждый цикл клеточного деления.
Синтез ДНК является последовательным И ПОЛУКОНСЕРВВТИВНЫМ Синтез ДНК начинается с расхождений цепей, каждая из которых служит матрицей для синтеза дочернсй цепи (как мы уже видели при рассмотрении структуры ДНК в гл. 2). Продуктами раунда реплнкацни являются две дочерние двухцепочечные молекулы, каждая из которых состоит из одной родительской (исходной) и одной (вновь синтезированной) дочерней цепи.
Таким ооразом, от одного поколения к другому передается одна из двух цепей, составляющих родительскую молекулу ДНК. Такой способ репликации носит название полунонсерватпвного. Схематически он изображен на рнс. 31.1. Если родительские цепи отличаются от вновь сннтезируемых по плотности — старые цепи «тяжелые», а новые «легкие»,— то первое поколение реплицировавшихся ДНК должно быть представлено «гибридными» двухцепочечными молекулами. Второе поколение, согласно этой модели, будет состоять нз одинакового количества |нб- 31.
Реплнкон: единица репликацпи 397 Та в нвчвлв рвпликвци« Нврижнняраввннвя ДНК Искаднля ДН К ф ! ) 1 1~ Ф ( Р( ~( ДНК паоле Г первага ув ( ДНК аслв Г вгсрага ф Исчсднвн ДНК В в с з рован . ДНК !Репликвция может праискадиуь в сбрвгнаы нвпрввлемии! Рвпянквция ! однОнаправленная ! Стецианврмвн точка ! начала Движущаяся репликецианнвя вилка Рвплнквниыжвн Г Репликвцин двунвпрввлвннвн репликвцианныв вилки Рнс. 3! !. Полуконссрватявный механизм рсллнкапин ДНК. ридных и легких двухцепочечных молекул, причем их индивидуальные отдельные цепи останутся тяжелыми или легкими.
Полуконсервативпый механизм был подтвержден экспериментально Меселсоном и Сталем в 1958 г. при изучении реплнкации ДНК Е со!г. Рассмотрим молекулу ДНК, вступающую в репликацию. Ее нереплицироввнная область представляет собой родительскую двухцепочечную ДНК, которая открываегся в уже реллицировавшейся области, состоягцей из двух дочерних двухцепочечных ДНК.
Точка, в которой происходит репликация, получила название реплнкацпонной вилки (иногда называемой точкой роста). Репликациопная вилка движется последовоглвльно вдоль ДНК от ее стартовой точки (рнс. 31.2). Репликация может осуществляться либо в одном, либо в двух направлениях. На рис.
31.3 показано, что это зависит от количества репликационных вилок, которые отходят от точки начала реплнкации. При однонаправленной реплнкации вдоль ДНК движется одна репликационная вилка. При двунаправленной реплнкации от точки начала в противоположных направлениях расходятся две репликационные вилки. С помощью электронной микроскопии реплицирующейся ДНК удалось установить, что область, которая уже реплицирована, имеет вид «глазка» внутри нереплицировавшейся ДНК. Этот глазок выглядит. одинаково нилкв Ю~~ЛхгуххУ'зЛЫ3.'Щ 1, '3 '~ЮМ~ЬЪ~ЯЪЪХЪЪ/~. Рвплнцнрсввкнвн Пс ванин! (Рсдигвлвсквн) ДНК ДНК Рнс.
3!.2. Реплнкдцнонндя вилка -это область между нердспле- тенной родительской двухцепочечной ДНК н вновь синтсэи- ровдннымн дочерними двойными цепямн ДНК. эсососочжочэосчяосососоьососчосососоьососососелзосочзк эочосчж Та кв нв влв Овиамвпрввнвннвл рвнликвцня рвплнквции ржосжососососо(сосок ъ осососоь охосососоч ъосососо5 чггСцгсчхцгсчгсосохчгччгд, Рвплнквц а нвн ~ Точка начала внлкв реплнквцин Двунвнрввмннв» рмлнквция у о;усекососщсосчгсососососсгсососососггсо(ососо, Т ж ленок ~,мм 3учочзоьочозочочаъочочоъотюьозоьоаочоъосиъж/. Рвпликвцианнвл Рвал «вцианнвя вилка Тг кв нвчвлв вилка рч нквцин Рнс. 3!.3. Реплнкдцня может быть однонаправленной нлн дву- направленной в зависимости от того, одна нлн лвс реплнкацнон- ныс вилки образуются в точке начала реплнкдцнн.
при однонаправленной и двунаправленной репликацин. Как изображено на рнс. 31.4, он может представлять любую из двух структур. При однонаправленной рспднкктр ции глазок имеет фиксированную точку начала и движущуюся репликационную вилку; при двунйправленнбй репликации он представлен двумя репликационными вилками. В любом случае продолжающаяся репликация расширяет глазок до тех пор. пока он не включит в себя весь репликон. В случае кольцевого репликона присутствие глазка способствует образованию О-структуры, изображенной на рнс.
31.5. Последовательные стадии репликации кольцевой ДНК вируса полиомы, зафиксированные под электронным микроскопом, показаны на рнс. 31.б, На микрофотографиях хорошо видно, что глазок увеличивается, Репликвцианный Нереплицираввннвя ДНК глазок Нвреппицираввннвя ДНК Рнс. 31.4. Реплнкдцнонный глазок может нрисутстдовдть при однонаправленной н нрн двунаправленной реплнкдпни. Часть 1Х.
Сохранение ДНК в ряду поколений 398 Вид В.структуры под электронным микроскопом реплицируюыаиси В структура Рнс 31.5. В кольцевой ДНК рспликвцнонный глазок образует О-структуру. а нсреплицированный сегменз. уменьшается. (В скрученных структурах можно определить обе стороны глазка, так как они имеют одинаковую длину.) Содержит ли реплицируюшийся глазок одну или две вилки, можно узнать двумя способами. Выбор метода зависит от того, является ли ДНК определенной молекулой или неопределенной областью клеточного генома. В случае определенной линейной молекулы мы можем использовать электронную микроскопию для измерения расстояния от каждого конца глазка до конца ДНК.
Затем положения концов тлазков в молекулах, имеющих эти структуры различных размеров, можно сравнить. Если репликация однонаправленная, только один из концов будет подвижным, друзой окажется фиксированным в точке начала репликации. Если репликация двунаправленная, перемещаться будут оба конца и точка начала репликации окажется равноудаленной от них. Определенную кольцевую молекулу ДНК необходимо перевести в линейную форму до электронной микроскопии (путем обработки рестрицирующим ферментом, разрезающим ес в уникальном сайте).
Для того чтобы помеппь движение репликационных вилок неопределенных областей больших геномов, используют следующие друг за другом радиоактивные импульсы разной интенсивности. Радноавтография таких препаратов показывает, что однонаправленная рспликация ведет к появлению одного типа метки, сменяемого другим.
в одном конце «глазка». Двунаправленная репликация приводит к появлению симметричных меченых участков с обеих сторон этой структуры (рис. 31пт). Бактериальный Геном представлен одним репликоном Геном Е. со!1 реплицирустся двунаправленно от одной точки начала, определенной как генетический покус оНС Первоначально точка начала была идентифицирована непрямыми методами, но в настоящее время выделена в виде фрагмента ДНК. В популяции бакзерий число копий генов, находящихся вблизи точки начала, увеличено, так как эта область рсплицируется рано в клеточном цикле. Следовательно, локализацию точки начала репликации и способ репликации можно распознать по увеличенному числу генов, расположенных поблизости.
Если репликация двунаправленная, число их уменьшается по мере увеличения удаленности от точки начала в любом направлении, Если клетки синхронизированы и репликация в них начинается в одно и то же время, ючку начала можно идентифицировать более точно, как сайт, в который включается короткая радиоактивная метка. Этот метод используют для выявления истинных стартовых точек репликации. ДНК области начала репликации может быть выделена благодаря ее способности поддерживать репликацию любой последовательности ДНК, к которой она присоелинена. Принцип такого подхода состоит в клонировании ДНК из области, несущей точку начала репдикации, в такой молекуле ДНК, которая имеет подходящие генетические маркеры, но утратила точку начала.
Подобная реконструкция приведет к образованию плазмиды, способной автономно реплицироваться лишь в том случае, если ДНК из области точки начала репликации будет содержать все необходимые для функционирования последовательности. (Такой подход быд использован для идентификации центромерной или теломерной ДНК у дрожжей по их влиянию на выживаемость плазмиды: ги 28.) Анализ последовательностей, соответствующих точкам начала репликации, связан с опрсделеннтями трудностями, поскольку плазмиды, несущие оНС, отличаются значительной нестабильностью. Однако в некоторых бактериальных штаммах такис плазмиды способны сохраняться.
Рекомбинантные плазмиды, в которые включен участок ДНК длиной около 1 т.п.н. из области опС, поддерживаются в клетках Е. той в количестве 1-2 копий на бакте- Рис Зьб. Реплнкациониый глазок увеличивается ло мере про- лвнження репликационных вилок вдоль рспликона. 31.
Репликон: единица репликации ЗОВ Оянонанравяанная рвпяннепия Дятнаправяв нее реп пианин — Неме енм ЛНК ! ев димая на рад оав а ра е! Лининметнис ет ойп о нсстню Линия мет и ст меп йпно нсстмо Рне. 3! 7. Для определения однонаправленною нлн лвунаправденното характера репликацнн можно использовать радиоактивную метку разной плотности. риальную хромосому, т.е. ведут себя как сама хромосома. (Однако присутствие дополнитедьных гочек начала может иметь неблагоприятные последствия для клетки; если нет возможности как-то различать точки начала, плазмидный и хромосомный оПС-покусы будут вынуждечы разделять между собой число инициационных событий, в результате чего число хромосом может уменьшаться.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
