Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 180
Текст из файла (страница 180)
Как конститутивный, так и факультативный гетерохроматин относятся к поздно реплицируюшимся структурам. Именно гетерохроматин обычно (хотя и не всегда) последним в клетке синтезирует ДНК во время Б-фазьь Это может быть следствием его более конденсированной структуры. Любой сегмент ДНК, имеющий точку начала репликации, способен реплицироваться. Отсюда следует, что, хотя плазмиды редко встречаются в клетках эукариот, их можно сконструировать путем соответствующих манипуляций ш зйго и ввести в соответствующие реципиентные клетки.
(В гл. Зе мы рассмотрим вопрос о судьбе ДНК, введенной в клетки эукариот.) Одной из систем, в которой внехромосомная ДНК способна реплицироваться, является ооцит Хепорпз. Инъецированная ДНК реплицируется в клеточном цикле только один раз, что свидетельствует о наличии соответствующего контроля. Однако в ооците Хепориз способна реплицироваться любая кольцевая ДНК, и можно сделать вывод, что специфическая точка начала в этой системе необязательна.
Другая система предоставляет возможность для выделения дискретных точек начала репликацин. Клетки дрожжей 5. сегелиае, мутантные по какой-то функции, могут быть «трансформированы» путем добавлении ДНК, которая несет копию гена дикого типа. Схема эксперимента представлена на рис. 31.13. Мутация клетки- хозяина должна затрагивать ген, продукт которого можно селектировать.
ДНК клеток дикого типа выделяют, фрагментируют и клонируют в составе плазмид Е, сой. Гибридные плазмиды инкубируют с мутантными клетками дрожжей в таких условиях, в которых эти клетки способны выжить только в случае экспрессии гена дикого типа. В зависимости от частоты возникновения трансформированных клеток различают два типа трансформации. Любой ген может быть трансформирован с низкой частотой.
Выживающие клетки имеют встроенную в хромосому копию донорного гена дикого типа. Вероятно, этот ген замещает исходный мутантный в результате гомологичной рекомбинации. Отсутствие какого-либо другого потомства доказывает, что донорный ген не спосо- Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений 404 Хромосома содержит к -ген ДНК нз дрожжевых леток х' фрвгментировзна и внедрена в плвзмиду Е.
сад Муганмая клетке дрожжед ! г г Плазмидм инкубируютсн с Г мутантным летками в условиях. г благо мннтнзх дпн грз сформацин ь- +' ! Ф. ! быозкзя часто а г граисформац 1 -О 1 Н з ая частота трансфор вции Хромосома содержм и тн.риро- ва ныя х+-ген Н азмида выж вае а зато о реппинирумжз сп ед н ца бен сохраниться в реципиентной клетке, если он не интегрирует с хромосомой. Следовательно, низкая частота трансформации объясняется, по-видимому, необходимостью интеграции.
Некоторые фрагменты дрожжевой ДНК способны трансформировать дефектные клетки с более высокой (примерно 1000-кратной) часлуогпой. Такие фрагменты выживают в клетке в неинтегрированном (автономном) состоянии, т.е. в форме исходно введенной кольцевой молекулы ДНК. Именно это, отсутствие необходимости в интеграции, и обусловливает высокую частоту трансформации. Фрагмент, трансформирующнйся с высокой частотой, обладает последовательностью, без которой эффективная репликация гибридной плазмиды в клетках дрожжей невозможна. Этот сегмент получил название агв-последовательности (от англ. аиуололуоив!у гер11сацлй вег)иелсе — автономно реплицнрующаяся последовательность). Возможно, именно она и есть подлинная точка начала реплнкации.
Известно, что агвпоследовательности встречаются примерно с той же частотой, которая характерна для точек начала репликации (одна на каждые 30-40 т.п,н.). У дрожжей точки начала реплнкации не относятся к семейству повторяющихся последовательностей. Вполне возможно, что много разных последовательностей способны обеспечивать функцию точки начала репликации.Уменьшая размер клонированных фрагментов,можно определить минимальную последовательность, необходимую для обеспечения агв-функции. Единственная область гомолое ии аге-элементов представлена канонической последовательностью нз 11 п.
н. (в каждом элементе может быть не больше трех замен). Обычно этн последовательности находятся в окружении А — Т-богатой ДНК. Точечные мутации аге-элемента приводят к тому, что область кора длиной 14 п.н, становится точкой начала репликацни. Кор содержит каноническую последовательность. Не исключено, что именно она является сайтом узнавания для белка, участвующего в проявлении функции точки начала репликации. Если в осуществление этой функции вовлекаются и другие последовательности, то у каждого из известных агв-элементов они разные.
Извест- Рис. 3!,13. Частота трансформации у дрож- жей зависит от того, происходит ли внедре- нно фрагмента в хромосомную ДНК нлн он сохраняется в виде плаэмнды. на и другая точка начала репликации в составе 2 мкмплазмнды дрожжей. Она также не имеет протяженной гомологии с агв-последовательностями.
Вполне вероятно, поэтому, что функцию точки начала реплнкации у дрожжей способны обеспечить много разных последовательностей. Рспликация может происходить по типу «глазков», «катящихся колец» или В-петель Вид структуры, формируемой в процессе ренликации, зависит от взаимосвязи между матрицей н репликационной вилкой.
Критическими факторами прн этом оказываются циркулярность или линейность матрицы и осуществление синтеза в репликационной вилке обеих нлн только одной цепи ДНК. До сих пор мы условно допускали, что репликационная вилка представляет собой сайт, в котором синтезируются обе новые цепи ДНК. В линейной молекуле независимо от того, идет ренликация в одном нли в двух направлениях, движение вилки (внлок) формирует юлазок» (рис.
31.4). Если матрицей служит кольцевая ДНК, реплнцнрующаяся молекула принимает форму 0-структуры (рис. 31.5), однако возможен и другой исход. Предположим, что репликация одной цепи двухцепочечной молекулы начинается в точке начала. Разрез открывает одну цепь, н свободный 3'-ОН-конец, образовавшийся прн этом, наращивается с помощью ДНК-полимеразы. Вновь синтезируемая цепь вытесняет исходную родительскую. Последуннцне события изображены на рис.
31.14. Такой тнп структуры получил название калулнГегосл кольца„ поскольку точка роста ггскользиттт вокруг кольцсвой матричной цепи. В принципе это может продолжаться неопределенно долго. При перемещении точки роста репликационная вилка наращивает внешний конец цепи и вытесняет предшествующего партнера.
Так как вновь сиптезируемый материал ковалентно сцеплен с исходным материалом, вытесняемая нить достирав~ размера исход- 3!. Репликон: единица репликации 405 Реапыв т а поста 5' соннеман епе 5' анена вамесннемоп цепи соответс вует ного генома в ее 5'-конце. За исходной единицей следует любое число единиц геномов, синтезируемых путем непрерывного вращения матрицы. Каждый цикл ведет к вытеснению материала, синтезированного в предыдущем цикле.
Катящееся кольцо используется ш Иуо несколько раз. У некоторых фагов геном представлен одноцепочечиой кольцевой ДНК. Такое кольцо сначала превращается в двухцспочечное, а затем реплипнруется посредством механизма катящегося кольца. Высвобождаемая цепь приводит к образованию серии геномов; они могут быть фрагментнрованы н внедрены в фауовые частицы; кроме того, возможно их использование в дальнейших репликационных циклах. (Такие репликацнонпые системы обсуждаются в гл. 33.) Освобождаемая отдельная цепь катящегося кольца может быть превращена в двухцепочечную ДНК путем синтеза комплементарной цепи.
Благодаря этому образуются конкатемерные двухцепочечные молекулы, необходимые для созревания определенных фаговых ДНК (гл. 28), например ДНК фага лямбда. Отметим, что данный способ образования конкатемерных молекул не единственный; для этого мохсет использоваться и рекомбинация, как в случае фага Т4. С помощью механизма катящихся колец образуется амплифицированная рДНК в ооцитах Хелория. Именно этим объясняется большое число идентичных повторяющихся единиц в амплифицированном материале (см. рис. 23.6).
Одна геномная повторяющаяся единица превращается в катящееся кольцо, прн этом вытесняемый конец превращается в двухцепочечную ДНК. В какой-то точке она отрезается от кольца, два конца соединяются, образуя амплифицированное кольцо рДНК. Другой тнп поведения репликацнонной вилки идентифицирован в некоторых митохондриях. Реплнкация начинается в специфической точке начала в кольцевой двухцепочечной ДНК. Но первоначально только одна из двух родительских цепей (Н-цепь в митохондриальной ДНК млекопитающих) используется в качестве матрицы для синтеза новой цепи. Синтез происходит только на коротком участке и вызывает вытеснение исходной комплементарной (Ь) цепи, которая остается одноцепочечиой (рис.
31.15). Происходящие в этой области события были названы «вытеенениемя (с((зр!асетепг), а образующаяся при этом структура Р-петлей. В митохондриях млекопитающих единственная Р- петля стабильна н состоит из 500-600 оснований. Короткая цепь имеет уникальный 5'-конец и вариабельный 3'-конец, образующийся, по-видимому, в результате терминацни синтеза в любом из 3 — 4 дискретных сайтов. Такая короткая цепь нестабильна; она часто деградирует н повторно синтезируется для сохранения в этом сайте двойной спирали в открытой форме. Некоторые митохондриальные ДНК, например у Х.
1иеи(д обладают одной длинной О-петлей. Другие могут иметь несколько Р-петель; например, в линейной митохондриальной ДНК Тела)уутепа обнаружено шесть О-петелзн Тот же механизм используется в хлоропластпой ДНК, где (у высших растений) существуют две П-петли. Чтобы реплицнровать митохондриальную ДНК млекопитающих, короткая цепь в П-петле вначале удлиняется. Вытесняемая область исходной Ь-цепи становится длиннее н расширяет О-петлю. Расширение продолжается до тех пор, пока не достигает точки, находящейся на расстоянии, составляющем примерно 67от длины кольца. Репликацня этой области раскрывает точку начала в вытесняемой Ь-цепи.
В этом сайте инициируется синтез Н-цепи, протекающий вдоль вытесненной одноцепочечной 1.-матрицы в противоположном направлении от синтеза Ь.-пипи. Из-за задержки в начале такого синтеза Н-цепь синтезируется только на 30-40% длины кольца к моменту завершения синтеза Ь-цепи. В результате освобождаются одна полная двухцепочечная кольцевая молекула и одна кольцевая молекула, содержащая брешь (пробел), которая до завершения синтеза Н-цепн остается частично одноцепочечной.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
