Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 183
Текст из файла (страница 183)
Уменьшение в Ь, т.е. отрицательная величина АЬ, соответствует введению комбинации отрицательных суперспиралей и (или) недокручиванию или уменьшению положительной суперспирализации (перекручиванию), Положительная величина Ы. свидетельствует об увеличении положительной суперспирализации (перекручнвания) или уменьшении отрицательной суперспирализации (недокручиваиия). Важной особенностью числа зацеплений является ннвариантность этого параметра.
Он характеризует лк>бую отдельную замкнутую молекулу ДНК (т.е. утратившую свободные концы). Число зацеплений не может быть изменено никакой деформацией молекулы, за исключением одной, включающей разрыв и воссоединение цепей. В результате кольцевая молекула с определенным числом зацеплений может выражать это число в значениях различных комбинаций Т и 1У, но не может изменять их сумму, пока цепи остаются целыми. (В самом деле, распределение Ь между Т и 1т' предотвращает существование фиксированных значений последних параметров для молекулы ДНК в растворе.) Теперь нам ясно значение числа зацеплений. Оно связано с лействительными ферментативными событиями, с помощью которых осуществляются топологические изменения в ДНК.
Фермент разрезает цепь или цепи, реорганизует их взаимосвязь в пространстве и затем соединяет между собой. Осуществляя это, он должен изменять число зацеплений на целое число. Его значение может характеризовать реакцию. Затем мы можем рассматривать эффекты этого изменения в значениях Л% и АТ. Топологические перестройки ДНК Перестройки, происходящие при репликации, могут быть связаны с реакциями, которые вызывают в отдельных молекулах ДНК структурные изменения более высокого порядка (в суперспирализации). Действительно, топологические перестройки ДНК-это основной аспект, который необходимо учитывать при рассмотрении всех ее функциональных активностей-рекомбинации, репликации и транскрипции. Следует напомнить, что для всех этих процессов дуплексная структура ДНК служит препятствием, которое преодолевается какой-либо реакцией, связанной с разделением цепей. Таким образом, все рекомбинационные события представляют собой топологические перестройки разных типов.
Разделения цепей требуют и все синтетические активности, связанные с двухцепочечной ДНК. Эта реакция может быть осуществлена при поглощении энергии, достаточной для разрушения нековалентных связей, которые стабилизируют двойную спираль. Одинаковые молекулы, отличающиеся только числом зацеплений, называются тоиологическими изомерами. Ферменты, с помощью которых топологические изомеры могут превращаться из одной формы в другую, получили название ДНК-тоиоизомераз. Это название заменило многие более ранние, такие, как ДНК-релаксирующий фермент, шарнираза, фермент раскручивания, фермент разрезания-сшивки. Некоторые топоизомеразы могут релаксировать (удалять) только отрицательные супервитки в ДНК; другие способны релаксировать как положительно, так и отрицательно суперскрученные молекулы.
Некоторые могут вводить отрицательные супервитки. Топо- 32. Топология репликации ДНК 411 нзомеразы делятся на два класса, в соответствии с природой механизмов, которые они используют. Ферменты типа 1 временно надрезают одну цепь ДНК.
Ферменты типа П производят временный двухцепочечный разрез. Наиболее полно охарактеризована топоизомераза типа ! нз Е. сей (первоначально названная белком со). Этот фермент эффективно релаксирует ДНК, отрицательно суперспнрвлизованную в высокой степени. Скорость процесса замедляется по мере приближения числа зацеплений к значению, характерному для поги!остью релаксированной ДНК. Фермент не действует на положительно суперспиралнзованную ДНК. Он кодируется ~сном гор; мутации в нем вызывают увеличение уровня суперспирализации в нуклеонде (и могут оказывать влияние на транскрипцию, как описано в гл.
1!). Наряду с релаксацией отрицательных суперспиралей в двухцепочечной ДНК фермент взаимодействует и с одноцепочечной ДНК. Это показывает, что причина его специфичности в отношении отрицательных суперспиралей заключена в способности последних стабилизировать одноцепочечные участки, обеспечивающие субстрат для связывания с ферментом. Фермен~ не узнает определенную последовательность мишени, но проявляет неслучайное узнавание сайтов на ДНК. Природа такой предпочтительности в отношении определенных сайтов неизвестна.
Прн связывании топоизомеразы 1 В. сей с ДНК образуется стабильный комплекс, в котором одна цепь ДНК разрезается и ее 5'-фосфатный конец ковалентно связывается с тирозиновым остатком фермента. Это указывает на механизм действия фермента, который перемещает фосфодиэфирную связь к белку, манипулирует структурой двух цепей ДНК и затем воссоединяет исходную цепь. Перенос связи от нуклеиновой кислоты к белку объясняет, каким образом функционирует фермент, не требуя какого-либо источника энергии.
В процессе реакции не происходит необратимого гидролиза связей; их энергия сохраняется после реакции переноса. Модель действия топоизомеразы 1 представлена на рис. 32.2. Фермент связывается с областью, в которой произошло разделение двух цепей ДНК, разрезает одну нз ннх, протаскивает другую через образовавшийся пробел и затем этот пробел залечивает. Такое событие изменяет число зацеплений на единицу за один раз. В каждом случае, когда одна цепь проходит через разрыв в другой, ЬЬ равно -Ь1. На рисунке показано действие фермента на примере перемещения отдельных цепей.
Однако в высокосуперскрученной молекуле свободная взаимозаменяемость % н Т должна приводить к нзменепию числа зацеплений за счет изменения А%= +1, т.е, за счет сбрасывания одного отрицательного сверхвитка. Реакция эквивалентна вращению, показанному на рис. 32.1, Г, с тем исключением, что данный фермент обеспечивает единственное протягнвание цепи за один раз.
(Наоборот, введение разреза в суперскрученную молекулу позволяет цепи свободно вращаться и уменьшать таким образом напряжение.) Топонзомераза 1 способна также протаскивать один сегмент одноцепочечной ДНК через другой. Последствия тако~о одиоцепочечиого перемещения показаны на рис. 32.3. Две одноцепочечные комплементарные кольцевые структуры способны ренатурировать, образуя двухцепочечное кольцо. Образование дуплексной области, соединяющей две кольцевые молекулы, должно породить экви- ! 1 ! 1 1 1 ! ! $ ! ! э Рис. 32.2. Бактернальные топонзомеразы типа! узнают частично Расплетенные сегменты ДНК н протягивают одну цепь через разрез, сделанный в другой цепи.
валентное недокручивание, т.е. отрицательные Т и % в каждом кольце. В отсутствие фсрмента это предотвращает дальнейшее спаривание. Топоизомераза 1 уменьшает напряжение, протягивая обе цепи в направлении, противоположном направлению вращения, вовлекаемого в спаривание. Это дает возможность реакции продолжаться. Если одноцепочечное перемещение осуществляется в двух частях одной и той же кольцевой молекулы, образуется узел.
о пюцчС .с + пе ажцпцпп у' Сцепппппп Рвс. 323. Реакция одноцепочечвого перемещения, осуществляемая топоизомеразами типа 1, может способствовать ренатурацин комплементарных колец олноцепочечной ДНК, зауэляванню однопевочечных ДНК н сцеплению кольцевых (разре- занных) дуплексных молекул ДНК. 32. Топология репликации ДНК 413 Разрыв в ) заднем сегменте — р' абилизаии ллмитальн витка — Ф Рггс. 326. ДНК-гираза способна вносить отрицательные супер- вигки в лвухцепочечпую ДНК посредством иггверсии положи- тельной суперспирали. ингибируется двумя видами антибиотиков, каждый из которых действует на определенную субъединицу.
Мутации, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, способствовали идентификации покусов, кодирующих субъедииицы ДНК-гиразы. Локус дугА (первоначально носивший название пи1А) контролирует устойчивость к налидиксовой и оксолиновой кислотам. Локус дугВ (ранее называвшийся сои) детерминирует устойчивость к каумермицину А1 и новобиоцину. Эти антибиотики подавляют репликапию, что, вероятно, свидетельствует об участии ДНК-гиразы в синтезе ДНК.
Активный фермент ДНК-гираза имеет структуру А В с общей мол. массой около 400000 дальтон. Субъединица ОугА имеет мол. массу, равную приблизительно 105000, субъединица Оуг — около 95000 дальтон. (Клетки Е. сой содержа~ субъединицы А в количестве, в 10 раз превышающем количество субъединиц В. Причиной этого является дополнительное связывание субъединицы А с белком, названным о, имеющим мол. массу 50000 дальтон который может быть фрагментом субъединицы В. Агрегат Ач получил название топоизомеразы 11 Е. сод; по-видимому, он является природным компонентом клетки.) Гираза связывается с субстратп ДНК, оборачивая се вокруг тетрамерного белка. Фермент защищает примерно 140 пар оснований ДНК от переваривания нуклеазой микрококка (подобно защите, обеспечиваемой значительно меньшим по размеру гистоновым октамером). Модель «инверсии знака», объясняющая действие ДНК-гиразы, представлена на рис.
32.6. Фермент связывается с ДНК в месте перекреста, эквивалентного положительной суперспирали. Это событие индуцирует образование компенсирующей отрицательной спирали в несвязанной части ДНК. Затем фермент разрезает двойную цепь в области пересечения положительной суперспирали, продевает через образующийся пробел другую дуплексную цепь и залечивает разрыв. В результате изменяется знак спирали от + 1 к — 1, а число зацеплений изменяется на величину АЬ = — 2. Последнее изменение происходит, согласно правилу изменения числа зацеплений, на величину, кратную двум, для случая двухцепочечных переносов. Один из пересекающихся сегментов образовавшейся отрицательно суперспирализованной молекулы освобождается от гиразы; по длине ДНК происходит перераспределение отрицательных супервитков (с изменением значений либо Т, либо %), либо и того и другого), и цикл повторяется снова. Тот же тип топологических перестроек ответствен за образование сцепленных и заузленных молекул, хотя роль таких перестроек )п туо неизвестна.
При отделении гиразы от инвертированной суперспирали ее конформация изменяется. Для того чтобы предпринять новый цикл суперспирализации, фермент должен восстановить свою исходную конформацию. Такой процесс получил название оборота фермента.
Полагают, что этот оборот осуществляется благодаря гидролизу АТР, поскольку замещение АТР непгдролизуемым аналогом позволяет гиразе ввести только одну инверсию ( — 2 суперспирапи) на субстрат. Следовательно, АТР це требуется для реакции суперспирализации, по необходим для осугцествления второго цикла этой реакции. Новобиоцин препятствует осуществлению АТР-зависимых реакций гиразы, предотвращая связывание АТР с субъединицей В.
Реакция релаксации (АТР-независимая) подавляется налидиксовой кислотой. Это свидетельствует в пользу того, что субъедийнца А вовлекается в осуществление разрыва и воссоединения. Обработка гиразы налидиксовой кислотой позволяет выделить ДНК в виде фрагментов, образованных в результате ступенчатого разреза поперек дуплексной молекулы. Концы содержат свободную 3'-ОН-группу и одноцепочечные 5'-концы протяженностью в 4 основания, ковалентно связанные с субъединицей А (рис 32.6).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
