Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 186
Текст из файла (страница 186)
Такой способ синтеза ДНК получил название полунепрерывной репликации. Синтез фрагментов Оказаки инициируется РНК Мы уже упоминали, что все известные ДНК-полимеразы, как прокариот, так и эукариот, способны удлинять дезоксирибонуклеотидную цепь от свободного ЗцОН- конца; однако ни одна из них не может инициировать синтез. Кроме того, события инициации должны происходить непрерывно, поскольку каждый фрагмент Оказаки отстающей цепи нуждается в своей собственной инициации йе почо. Синтез каждого фрагмента Оказакн начинается с затравки, короткой последовательности, обеспечивающей 3'-ОН-конец для удлинения цепи с помощью ДНК-полимеразы.
Затравкой служит РНК, длина которой соответствует примерно 10 основаниям. Для образования непрерывных цепей ДНК пробелы должны быть застроены и фрагменты Оказаки соединены. Мы можем теперь подробнее обсудить события, которые приводят к воссоединению фрагментов Оказакн (рис. 32.13). Их порядок еще не установлен, однако очевидно, что он должен включать удаление РНК-затравки, ее замещение удлиняющейся ДНК и ковалентное связывание смежных фрагментов. На рисунке показано, что синтез фрагментов Оказаки термннируется как раз перед стартовой точкой РНК-затравки предшествующего фрагмента.
Фермент ДНК-полимераза 1, вероятно, вовлекается в застройку пробела, образуемого при удалении затравки, поскольку у мутантов ра!А фрагменты Оказаки должным образом не соединяются. Действительно этот фермент может использовать свою 5' — Зцэкзонуклеазную активность для удаления РНК-затравки с одновременным замещением ее последовательностью ДНК, синтезируемой с ЗцОН-конца соседнего фрагмента Оказаки.
Она эквивалентна активности при смещении разрыва, с той разницей что в этом случае новая ДНК замещает РНК, а не сегмент ДНК. После удаления РНК и ее замещения остается только соединить смежные фрагменты Оказаки. После застройки пробелов 3'-ОН-конец одного фрагмента присоединяется к 5'-фосфатному концу предыдущего фрагмента. За соединение концов отвечает фермент ДНКмчигаза 1о котором мзя уже говорили в связи с его использованием в экспериментах ш чпго при реконструкции ДНК).
Лиг'азы присутствуют в клетках как прокарнот, так н эукариот; наиболее полно изучены лигазы Е. сой и фага Т4. Об участии лигнрующих 1сшнвающих) ферментов в процессе воссоединения фрагментов Оказаки ш ч)чо свидетельствует неспособность к их соединению мутантов 1гд Ферменты Е. сой и Т4 могут залечивать разрывы, имеющие 3'-ОН- и 5чфосфатные концы 1рис.
32.14), хотя используют для этого разные кофакторы; Е. сой — )т)АО 1никотинамндацениндинуклеотид), а лигаза фага Т4- АТР. Оба фермента участвуют в двухступенчатой реакции, на первом этапе которой образуется комплекс фермент — АМР. У Е. сей это достигается путем отщепле- 32.
Топология репликации ДНК 419 РНК.ааграака Фрагменг Окааакн l Π— Р О ! о- Фермена е АТР (фаг Т4) Π— Р=О 1 О 1 Π— Р=О ! Рибоаа Адегин Уда пение Р Н К Зем рык НК ЩШ м ! ! ),'; г ( ' ( ( )э ( 1 1 1;., ! 1 ' ' Ч)"'.ТТ')т7ти) "1 'Т" О +ЯЫР Рнс. 3214. ДНК-лнгаза залечивает разрывы между смежными нуклеотидами, используя промежуточный комплекс фермент- АМР. Рекомендуемая литература В настоящее время топоизомеразам посвящено большое количество публикаций. Различие между типами топоизомераз рассматривают Лю с соавт. (Ии е( а!н Се)1, 19, 697-707, 1980) и Козарелли )Соегагей(, Се11, 22, 327-328, 1980).
Функции гиразы обсуждает Козарелли (Сояхаге!!1, Бс!епсе, 207, 953-960, 1981). Общий анализ всех топоизомераз осуществлен Геллергом (бе!!егс, Апп. йеч. Вюсйе(пн 50, 879 — 910, 1981). Эукариотические ДНК-полимеразы рассматривает Хуберман (ННЬегтал, Се!1. 23, 647-648, 1981). Сведения о репликации и ферментах, участвующих в этом процессе, можно найти в гл. 33. Рнс 33 ) 3. Соединение фрагментов Оказакн между собой может быть осуществлено после удаления РНК, застройки пробелов н объединения концов.
ния )к)МХ от )к)А)3, а у фага Т4 — пирофосфата от АТР. Образовавшийся комплекс присоединяется к 5ьфосфатному концу фрагмента через АМР, затем образуется фосфоднзфнрвая СВяэ(н СОЕднляЮщая ЕГО С ЗЬОН-КОНЦОМ другого фрагмента, при этом фермент и АМР освобождаются. Описанные выше факты поставили проблему, касающуюся специфичности синтеза фрагментов Оказаки. Какой фермент отвечает за синтез РНК-затравки? Осуществляется ли начало и остановка ее синтеза в специфических последовательностях, или эти события определяются организаций репликационной вилки? Продолжается ли синтез фрагмента Оказаки до встречи со смежным фра)= ментом, или существую~ специфические точки терминации? ) нкн фермена г НЯО ( е сед ) ~-Ферммг-Анре Ррнфагтд) «пинии (Е.
сер) Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений 420 Глава 33 ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ АППАРАТ РЕПЛИКАЦИИ ДНК Репликация двухцепочечной ДНК вЂ” это сложный процесс, требующий нескольких ферментативных активностей. Прежде всего необходимо разделение родительских цепей и их временная стабилизация в одноцепочечном состоянии.
Далее должна быть инициирована репликация ведущей цепи, и затем эта цепь должна удлиняться. Кроме того, постоянно инициироваться, удлиняться и соединяться между собой должны фрагменты Оказаки отстающей цепи. В конце репликации необходимы реакции соединения и(или) терминации. Указанные события могут контролироваться отдельными белками или группами белков, но, поскольку эти белки функционируют взаимосвязано, вполне вероятно, что разные активности принадлежат дискретной структуре мультибелка, иногда называемого реплисомой. Реплисома не выявляется в виде свободного клеточного компонента, подобного, например, рибосоме; очевидно, она собирается из отдельных компонентов в начале репликацин.
Таким образом, реплисома может существовать только как белковый комплекс, связанный с определенной структурой, которую ДНК приобретает в репликационной вилке. В настоящее время исследования процесса сборки белков, включаемых в репликацию эукариот, только начаты. При определении компонентов репликационных аппаратов бактерий и фагов использованы два подхода, дающие совпадающие результаты, Во-первых, с помощью мутаций, нарушающих репликацию, удалось идентифицировать гены, продукты которых либо являются компонентами аппарата репликации, либо выполняют вспомогательные функции. Во-вторых, для изучения репликации )п гйго в качестве матриц могут быть использованы геномы определенных мелких фагов.
В изучении репликационного аппарата достигнут заметный прогресс, поскольку каждый его компонент доступен для изучения в системе ш тйго как биохимически чистый продукт, и участие в репликации ш ч1чо различных компонентов идентифицируется по эффекту мутаций в их генах. Сложность репликационного аппарата бактерий Неспособность реплицировать ДНК-летальное событие для любой клетки, Поэтому можно выделить лишь условно-летальные мутанты по репликации, способные осуществлять этот процесс при пермиссивных условиях (при нормалыюй температуре ипкубации) и проявляющие свой дефект только при непермиссивных условиях (при температуре 42'С).
Такие термочувствительные мутанты позволили идентифицировать серию локусов, описанных как гены дла. Мутанты Ыла на основе их поведения при повышенной температуре разделены на два класса. Мутанты с замедленной остановкой ренликации завершают текущий раунд репликации, но оказываются неспособными начать новый раунд. Следовательно, у них нарушен цикл инициации репликации в точке ее начала (локусе он), О мутантах этого класса известно немногое (см.
ниже табл. 33.3). Основной вывод сводится к тому, что лля инициации цикла репликации необходимо несколько различных белков. Мутанты с быстрой остановкой реплнкации прекращают этот процесс при повышении температуры немедяенио. Те из них, которые имеют отношение непосредственно к репликации, являются дефектными по компонентам реплисомы (см.
ниже табл. 333). Следует отметить, что среди мутантов, отнесенных к классу быстро останавливающих репликацию. могут быть также и дефектные по инициации репликации, хотя зто скрыто их фенотипом. У некоторых штаммов с быстрой остановкой репликации нарушено образование предшественников, необходимых для синтеза ДНК. Например, мутации нЫА, первоначально названные благ, повреждают ген, кодирующий субъединицу рибонуклеотидредуктазы, которая существенна для обеспечения синтеза ДНК предшественниками. Точно так же мутации диг , исходно названные мутациями дна5, элиминируют активность гП)ТРазы. Наличие таких мутантов свидетельствует о важности обеспечсния предшественниками процесса репликации ДНК. Следовательно, выделение мутаций с фенотипом Ппа не указывает, что продукт гена, повреждаемого мутацией, непосредственно вовлекается в процесс репликации.
Несмотря на интенсивные усилия, затраченные на выделение мутаций дла, до сих пор еще не идентифицированы все функции, необходимые для репликации. Известно, что для функционирования систем репликации 1п Игго (см. ниже табл. 33.2) необходимо несколько дополнительных белков, кодируемых неизвестными генами. При испытании экстрактов из клеток Е. сой на способность синтезировать ДНК доминирующей ферментативной активностью во всех случаях была активность ДНК-полимеразы 1. В ее присутствии оказывается невозможным определить активности ферментов, действительно ответственных за репликацию. Вот почему для изучения этого процесса (п Игго используют экстракты клеток мутантов ро(А. Определенный интерес представляют системы, в которых хотя и не удается проанализировать отдельные компоненты, однако можно более четко, чем в обычных условиях )и ч)чо, охарактеризовать процесс репликации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
