Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 184
Текст из файла (страница 184)
Ковадентная сшивка сохраняет энергию фосфатной связи; она может быть использована для проведения повторной реакции, что объясняет ее способность осуществлять релаксацию в отсутствие АТР. Сайты разрезания довольно специфичны и встречаются примерно один раз на каждые 100 пар оснований. ДНК-полимеразы эукариот Эукариотические ДНК-полимеразы наиболее полно изучены у млекопитающих. Первый эукариотический фермент такого типа был вьщелен из тимуса теленка еше в 1960 г. Как правило, ДНК-полимеразы эукариот обладают только ДНК-синтезирующей активностью, в то время как большинство бактериальных ферментов могут выполнять также функции экзонуклеаз. У эукариот известны три класса ДНК-полимераз.
Их свойства суммированы в табл. 32.1. Может ли одна из Часть 3Х. Сохранение ДНК в ряду поколений 414 цию определенных матриц. Были созданы ядерные системы, содержащие все компоненты, необходимые для продолжения движения репликационной вилки.
Однако инициацию синтеза в стартовой точке репликации в системе !и чпго еше не удалось воспроизвести. Таблица 32.1 В клетках млекоцатаюьчах содержатся трц ДНК-аолииеразы ДНКчюлимараэа а ДНК-пола- ДНК-полимораза Е мараза т Ядерная ц мито- хоцдриа.чьцая Ядерная, однако при выделении переходит а цито- плазму Ядерная Локализация ДНК-полимеразы прокариот проявляют несколько ферментати нных активностей 10-15 Степень актив- 80 ности, % Размер (а даль- 110-220000 тонах) У Е со!! обнаружены три ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза 1, вовлекается в репарацию повреждений ДНК и участвует в процессе полуконсервативной репликации, выполняя вспомогательную роль. Она кодируется покусом ро!А.
Второй фермент, ДНК-полимераза П, детерминируется геном ро!В. О его функции (п чьчо ничего не известно. Третий фермент, ДНК-полимераза П1, представляет собой сложный белок, состоящий из многих субъединиц, включая субъечиницу, кодируемую локусом ро!С (известным также как ИцаЕ), Фермент выполняет функции репликазы и отвечает за синтез де поко новых цепей ДНК.
Данные об активностях трех ферментов представлены в табл. 32.2. Все ДНК-полимеразы про- и эукариот обладают одной и той же основной синтезирующей активностью. Каждая из пих способна удлинять пень ДНК, последовательно наращивая по одному нуклеотнду к ЗьОН-концу. Таким образом, синтез новой цепи осуществляется в направлении 5' — 3'. Реакция схематически изображена на рис. 32.7. Предшественником синтеза ДНК служит нуклеозидтрифосфат, который в процессе реакции утрачивает две конечные фосфатные группы. Выбор нукчеотида, добавляемого к цепи, диктуется спариванием основания с матричной цепъю, Точность процесса репликации зависит от тех же причин, которые мы уже обсуждали при рассмотрении процесса трансляции.
Она определяется специфичностью спаривания оснований. Ожидаемая при этом частота встречаемостн ошибок находится в пределах от 1О 4 до 1О на реплицируемую пару оснований. Действительная частота ошибок в клетках Е сой или при репликации ДНК фага Т4 колеблется в пределах от 10 а до !О 'о на реплицируемую пару оснований.(Это соответствует приблизительно одной ошибке на !000 репликационных циклов 45 000 них быть идентифицирована в качестве подлинной репликазы? ДНК-полимераза ц является единственным ферментом, уровень которого возрастает во время Б-фазьь Она устойчива к 2'3'-дидезокситимидинтрифосфату; аналог не подавляет репликационные системы !п ч)1го, но ингибирует полимеразы (3 и у. Антибиотик афидиколин, выделенный из грибов, подавляет реплнкацию эукариотической ДНК щ ч(чо; единственный фермент, который он ингибирует 1п яйго — ДНК-полимераза щ Следует отметить, что ДНК-полимераза и, выделенная из мутантных клеток, устойчивых к афидиколину, также нечувствительна к этому антибиотику щ г(1го.
Полученные результаты позволили идентифицировать ДНК-полимеразу и как ядерную ДНК-репликазу. Кроме репликации ДНК-полимеразы выполняют репарирующие функции, с помощью которых замещаются сегменты поврежденной ДНК. По-видимому, в этом принимает участие ДНК-полимераза (3. Роль ДНК-полимеразы у предположительно сводится к осуществлению репликации митохондриальной ДНК. Ее роль в ядре (если она в ядре функционирует) неизвестна.
Репликация ДНК наряду с ДНК-полимеразами требует участия многих других ферментов. Трудности при анализе роли эукариотических ДНК-полимераз обусловлены отсутствием систем, содержащих все необходимь|е для репликацин компоненты. В последнее время, однако, появилась возможность осуществлять (п 911го реплика- ДНК-поламараэа 1 ДНК-аоламараза Н ДНК-поаимараза Н1 ) Размер (а даль- тонах 250 000 109 000 120 000 ство молекул клетку татяацая ность Одна цепь 400 Гетеромультимер 1Π— 20 Элоцгация а направлении 5' 3' от У-ОН-затравки 3' -~ 5'-экзоцуклеаза Ро!В-мутанты це имеют фсцотяпического проявления Табьзма 32.2 В клетках Е.
сод содержатся тра ДНК-аоаямаразы Злоягацця а направлении 5'-~ 3' от 3ьОН-затравки 3' -~ 5ьэкэонуклеаза )Г' 5' -~ 3'-экзонуклеаза ! ро!А-мутанты дефектны в репарцруюших актиаиостах, повреждение 5' -~ Зсэкзонуклеазцой активности снижает их жизнеспособность Элоигацяя а направлении 5'-~ 3' от 3'-ОН-затравки 3' 5сэкзонуклеаза 5' -~ 3'-жзоиуклеаза ро!С, Ацаг1, ццаХ, даа7.- условие летальные мутанты по Реплцкация ДНК 32. Топология репликации ДНК 415 бактериальной ДНК, или примерно 10 а на один ген на поколение.) Фермент может контролировать выбор комплементарного основания на любой (или в обеих) из двух стадий. Путем специфического узнавания определенного химического признака он может тщательно проверить поступающее основание относительно его комплементарности с матричным основанием.
Таким образом осуществляется контроль за ошибками на стадии, предшествующей синтезу. Проверка правильности подбора основания возможна и после добавления основания к цепи. В тех случаях, когда была допущена ошибка, удаляется самое последнее из присоединенных оснований. Все бактернальные ферменты обладают 3' — 5'-экзонуклеолитической активностью, которая, по-вндимому, и осуществляет функцию исправления ошибок. Отсутствие такой активности у ферментов эукариот свидетельствует о том, что в их клетках должен существовать какой-то другой механизм контроля частоты ошибок. 3' " 5'-Экзонуклеолитическая активность проявляется в направлении, обратном синтезу ДНК.
Действие фермента, исправляющего ошибки, схематически показано на рнс. 32.8. На стадии роста цепи нуклеотид предшественник занимает положение в конце растущей цепи. Формируется связь. Фермент передвигается дальше на одну пару оснований, готовую к спариванию со следующим нуклеотидом-предшественником. Если происходит ошибочное спаривание, фермент перемещается в обратном направлении и вырезает последнее добавленное основание, на место которого может присоединиться правильный нуклеотид-предшественник.
Такого рода активность была наиболее полно охарактеризована у фермента ДНК-полимеразы 1, однако вероятно, что другие ДНК- полнмеразы прокариот функционируют аналогично. ДНК-полимераза 1 представляет собой необычный фермент с несколькими активностями. Она содержит один полипептид с мол. массой !09000 дальтон. При протеолитической обработке полипептидная цепь делится на два отрезка.
Большой фрагмент (7б 000 дальтон) проявляет 5' — Зчполимеразную и 3' — 5ьэкзонуклеазную активности. Малый фрагмент (Зб 000 дальтон) обладает другой активностью — 5' — Зсэкзонуклеолитической. Последняя поэтому оказывается независящей от синтезирующей (исправляющей ошибки) активности. С помощью 5' — Зчэкзонуклеазной активности вырезаются небольшие участки, содержащие до !О нуклеотидов, ДНК-полимераза 1 проявляет уникальную способность инициировать репликацию ш у)(го в месте разреза ДНК. В точке, где разрушена фосфодиэфирная связь в двухцепочечной ДНК, фермент удлиняет ЗСОН-конец, Когда новый сегмент ДНК синтезирован, он замещает существующую гомологичную цепь в двойной цепи.
Такой процесс «смещения разрыва» показан на рис, 32.9. Замещаемая цепь деградирует с помощью 5' — Зсэкзонуклеолитической активности фермента. В результате сохраняется ДНК с неизменными свойствами, за исключением того сегмента ДНК, который был замешен вновь синтезированным материалом, где положение разрыва оказалось сдвинутым по длине двойной цепи. Такой эффект имеет большое практическое значение, так как именно он позволяет внедрить в ДНК )и у)1го радиоактивно меченные нуклеотиды. Смещение разрыва (пик-трансляция)- это основной метод, используемый для получения радиоактивно меченной ДНК. Хотя в бактериальной клетке содерхгится большое ко- но Р 5 .'~ЕР о~ — он з но Р 5' 5' Р ОН 3'+РР Рнс.
32,7 Синтез ДНК осуществляется посредством добавления пуклеотидов к 3сОН-копну растущей пепи. Таблнна 32.3 Различные кпмбннаннн субъелнннп приводят к образонанню раз- ных форм ДНК-полямеразы И1 Субь- Раамер Другое пааменоаапне н Субьедппппи соаержагая а еда. (а даль- (плл) геа пипа гопак) Кор Роли Роцц ' Голо Роц!1 фер- . мент ~ ро(С(г(па)Е ! Ипа)г)-фактор 1- коРо! Шп дл Хф Р )ф ° РП фактор П1) днаХ 140 000 40 000 32 000 52 000 25 000 10 000 53 000 " Сгелаомегрня раалачпьп комплексов ле определ большансгае случала содержится только по одной копи а субьедпппп.
личество ДНК-полимеразы 1, она не отвечает за репликацию, которая продолжается в мутантах ро(А. Ее 5' — Зчсинтезирующая)3' — 5чэкзонуклеолитическая активности, вероятно, используются гп у!со для превра)йащд.. одноцепочечных участков в двухцепочечные. Такие участки возникают во время репликации (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
