Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 189
Текст из файла (страница 189)
Другие покусы идентифицированы только с помощью мутаций. Исключение составляет г(паК, относящийся к группе покусов, выражение которых стимулируется температурным возлействием. Было замечено удивительное сходство между последовательностями белка )ЗпаК и основного белка «теплового шока» О. Гл«1алодагиег, который сзановится доминирующим в условиях воздействия высокой температуры на клетки насекомых. Такое сходство между белками прокариот и эукариот остается пока загадочным. Об участии РНК-полимеразы в инициации репликацни в сайте оп' свидетельствовали данные, показывающие, что начало репликации бактериальной ДНК можно подавить рифампицином в период, когда ингибиторы белкового синтеза оказываются неэффективными. Это значит, что, по-видимому, важен именно синтез РНК (а не ее трансляция и образование белка).
Подходящей системой для изучения этой функции может служить фаг лямбда, сайт инициации которого позволяет вести двунаправленную репликацию и, кроме того, способен приобретать структуру «клеверного листа»а подобную той, которая постулнрована для Е. сок Иницнапня репликацин в сайте начала репликацни ДНК фага лямбда требует «активапии» посредством транскрипции. Реплнкацня фага лямбда не может быть инициирована, если репрессор связан с Ои, так как связывание предотвращает транскрипцию, которая инициируется в Ри и проходит через сайт начала репликации.
Карта этой области представлена на рис. 33.6. Необходимость в синтезе РНК не обязательно связана с синтезом РНК-затравки для реплнкацин ведущей цепи. Возможно, что синтез РНК играет роль в индукции некоторых структурных изменений в этой области. В репликации фа|а лямбла участвуют белки, коднруемые фаговыми генами О и Р, н, кроме того, несколько бактериальных белков, в частности тех, повреждение которых вызывает замедленную осгановку репликации. Белок О связывается с фаговым покусом он; белок Р взаимодействует с белком О и бактериальными белками.
Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений 426 р,о, оо Траискр пц н дпл Реплииаци Ролика которан иииции. иаеииатии апаса Ртетсн илеса 5' з з 5' 5' з' РМРМРМРМРМРМРМРМРМРМРМРМР РМРМРМРМРМРМРМРМРМ й о М рйрйрйрйрйойзйрйрйрйрйрйойойрй — ОН рйрй РМРМРМРМРМРМРМРМРМРМРМРМРМРМРМРМРМРМРМ 3 +-+-+ — 5 з' Рис 33.6. Для активации точки начала Репликации требуется инициация транскрипции в промоторе Рк. Локус оН расположен в пределах гена О, так что белок действует вблизи места своего синтеза.
Существуют варианты фага, Ыц имеющие более короткие геномы, в которых заключена информация, необходимая для репликации. Тем не менее такие фаговые частицы утрачивают инфекционные функции и могут сохраняться в бактерии в виде плазмид. ДНК уи(р может реплицироваться )п ч11го с помощью системы, содержащей кодируемые фагом белки О и Р, а также репликационные белки бактерии-хозяина. Эта система дала возможность проанализировать роль транскрипционной активации. Наличие плазмид, несущих последовательность оНС Е. сой, позволило получить бесклеточную систему, в которой репликация осуществляется, инициируясь в этом локусе.
Инициация репликации плазмиды подавляется рифампицином, а также соединениями, предотвращаю- шими функционирование ДНК-гиразы. Подавляют реакцию и антитела против белков ОпаВ или ББВ; в то же время экстракт, приготовленный из мутантных клеток 13паА, неактивен. Существуют две гипотезы относительно инициации синтеза ведущей цепи. Одна из них предполагает использование РНК-затравки, которая должна действовать так же, как в случае инициации синтеза фрагментов Оказаки на отстающей цепи, за исключением того, что синтез затравки должен сопровождаться непрерывным удлинением цепи, Альтернативная возможность связана с образованием разрыва в родительской цепи и использованием ее 3'-ОН-конца в качестве матрицы, как это показано на рис. 33.7. В конечном счете ковалентная связь между дочерней и родительской цепями должна быть разрушена.
Установлено, что механизм репликации, заключающийся в разрыве и последующем удлинении родительской цепи, свойствен многим фаговым ДНК. Репликация происходит по типу катящегося кольца. Этот способ репликации (см. рис. 31,14) изучали, используя РФ-форму ДНК фага фХ174. Синтез по типу катящегося кольца требует участия меньшего количества ферментативных функций, чем в случае образования репликативной формы ДНК из исходной вирусной цепи.
Суперспирализованные кольца ДНК фага фХ174 могут быть реплицированы щ Игго с помощью системы, содержащей продукт фагового гена А и бактериальные белки йер, ББВ и ДНК-полимеразу П1. Белок А разрезает вирусную (+ )-цепь дуплексной молекулы в специфическом сайте, определяющем начало репликации РФ-ДНК.
ДНК может быть разрезана только в том случае, если она суперспирализована. Белок А способен связываться с одноцепочечным фрагментом ДНК длиной десять нуклеотидов, который окаймляет сайт разрыва. Отсюда следует, что суперспирализация необходима для образования одноцепочечной области, обеспечивающей белку А его сайт связывания. В результате разрыва образуются ЗчОН и 5'-фосфатный конец, и каждый из них играет определенную роль в репликации ДНК фага фХ!74. В присутствии белков Вер и БЯВ, а также АТР разрезанная ДНК расплетается (рис. 33.8).
Белок йер обеспечивает функцию геликазы, которая разделяет цепи; белок ББВ фиксирует их в одноцепочечной форме. Белок А остается ковалентно связанным с 5'-фосфатным концом; кроме того, он связан с белком йер и передвигаешься по кольцевой молекуле вместе с ним. В результате замещаемая цепь «выпетливается» из сайта расплетания. Завершение движения по кольцу веде~ к освобождению кольцевой комплементарной ( — )-цепи и линейной вирусной (+ )-цепи. Если в систему включена ДНК-полимераза 111, 3'-ОН- конец разрезанной цепи наращивается. Цепь растет вдоль Рис.
33.7. Синтез ведущей цепи может быть инициирован РазРезом, вызывающим образование 3чОН-конца, с которого начинается синтез новой цепи, вытесняющей исходную цепь. 33. Ферментатнвпый аппарат репликации ДНК 421 Разрез онл е цепь Рнс. 33.8. РФ ДНК фага фХ174 может быть разделена на отдельные цепи в результате разрезания, осуществляемого белком кольцевой ( — )-цепи матрицы до тех пор, пока она не достигнет стартовой точки и не вытеснит исходную цепь, как это показано на рис.
33.9. Поскольку белок А движется по кольцевой молекуле вместе с Кер-белком, в момент достижения растущей точкой сайта инициации репликации он оказывается вблизи этого участка, в результате чего тот же белок А снова узнает точку начала репликации и разрезает цепь, прикрепившись посде этого к концу образованного разреза. Такой цикл может повторяться неограниченное число раз. Вслед за событием разрезания вытесненная ( + )-цепь освобождается в вице линейной молекулы, которая может повторно приобрести форму кольца. Белок А вовлекается в процесс образования кольцевой структуры. На самом деле соединение Зч и 5'-концов ( + )-цепи может осуществляться белком А в процессе реакции, с помощью которой он отделяется от цепи и прикрепляется к концу нового разреза.. Белок А обладает необычным свойством, которое может быть связано с его активностями; )п иапо он действует только в цнс-положении, олнако (п у(1го при добавлении к бесклеточной системе активен на любой матричной ДНК.
Это означает, что (п у(уо белок А, синтезированный определенным геномом, способен присоединяться только к ДНК этого генома. Мы не знаем, как это происходит. Однако активность этого белка (п Игго показывает, каким образом он может оставаться связанным с одной и той же родительской матричной ( — )-цепью. В случае морфогенеза фага в цикле имеет место модификация.
Вместо связывания вытесненной (+ )-цепи с белком ББВ (и повторного вступления в цикл репликации) она упаковывается в фаговый вирион. Рнс. 33.9 РФ ДНК фага фХ174 может использоваться в качестве матрицы для синтеза одноцепочечных кодьцевых молекул ДНК вируса. Белок А остается прикрепленным к тому же геному в течение неограниченного числа циклов, каждый раз про- А, раскручивания с помощью белка пер и стабилизации от- дельных цепей белком ЯЯВ(бзЬ).
Реиугикационный аппарат фага Т4 При проникновении фага Т4 в клетку Е сей он обеспечивает появление множества своих собственных функций, которые либо замещают, либо дополняют функции хозяина. Поскольку ДНК хозяина деградирует, фаг не может использовать функции, требующие экспрессии генов хозяина, и использует только те ферменты, которые обычно присутствуют в клетках бактерий в больших количествах. Деградация ДНК бактерии-хозяина необходима лля освобождения нуклеотндов, которые затем используются при синтезе фаговой ДНК.
(Фагоная ДНК отличается по составу оснований от клеточной ДНК: вместо цитозина она содержит гидроксиметилцитозин.) Фаговые гены, участвующие в синтезе ДНК в инфицированной клетке, можно идентифицировать с помощью мутаций, которые предотвращают или задерживают образование зрелых фаговых частиц, Наиболее важные нз них (существенные гены) идентифицированы при изучении условно-летальных мутантов, которые можно отнести к трем фенотипическим классам. Если в результате мутации синтез ДНК полностью подавлен, можно сделать вывод, что белок, кодируемый мутантным геном, либо представляе~ собой необходимый компонент репликационного аппарата, либо участвует в обеспечении синтеза ДНК предшественниками (особенно гидроксиметилцитозином). Мутации, вызывающие задержку синтеза ДНК, по-видимому, затрагивают гены, связанные с инициацией репликации ДНК. Фаги, у которых синтез инициируется, а затем останавливается, вероятно, несут мутации, затрагивающие регуляторные функции, ДНК-лигазу и некоторые ферменты, связанные с деградацией ДНК клетки-хозяина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
