Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 190
Текст из файла (страница 190)
Имеются также несущественные гены, изводя разрез в точке начала репликации на вирусной ( Ь )чаепн и перемещаясь к новому 5сконцу. В то же время вьпесненная вирусная цепь образует кольцевую форму. 428 Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений Табянна 33.4 Ревликавввиный авварат фага Т4 состоит вз определенных ком- п»»евган Функция Размер продукта (» да»ь ю»ах) Г»н Относи- ~»»ь»ое КОЛИ- чество молекул ДНК-полил~ераза ! !0000 Белок, связывающийся с 35000 олиопепочечной ДНК ) 1 АТРаза, увеличивает !4 к 34000~!80000 скорость в 3-4 раза) 2 х 22000) комп- 43 32 44 лекс ~ 41 61 ОТРаза, стимулируемая 58 000 олнонепочечной ДНК; участвует в синтезе РНК-затравкн Учасэвует в синтезе РНК-затравкн Неизвестна, но, по-вндн- 2 х 27 000 мому, помогает ДНК-полнмеразе 20 связанные с репликацией; например, те, которые участвуют в гликозилировании гидроксиметилцитозина в ДНК.
Синтез ДНК фага Т4 катализнруется мультиферментным агрегатом, собираемым нз продуктов семи существенных генов. Каждый нз компонентов был проверен в комплементационном анализе в опытах !и И!го. Система активна при использовании нескольких матриц ДНК !и чйго; она действует со скоростью, близкой к природной, и частота ее ошибок колеблется в пределах от !О з до !О» (!и И»о эта величина составляет примерно 2 !О»].
Следует отметить, что в системе ш чйго СТР используется так же эффективно, как гидроксиметил-СТР. Белки реплнкацнонно~ о комплекса фага Т4 охарактеризованы в табл. 33.4. Белок гена 32 — высококооперативный, связываюшийся с одноцепочечной ДНК н необходимый в стехиометрических количествах. Этот белок бьп первым охарактеризованным белком такого типа. По-видимому, он необходим для правильной геометрии реплнкационной вилки фага Т4, поскольку белок 8$В из Е. со!1 не заме~цвет его.
Белок гена 32 образует комплекс с ДНК-полимеразой фага Т4; это взаимодействие, по-видимому, важно для образования реплнкационной вилки. Репликация ДНК фага Т4 зависит от синтеза РНК-затравки, Однако по своей природе фаговая за~ранка отличается от той, которая образуется в Е. со)1. Продукты генов 41 н 61, действуя совместно и используя одноцепочечную ДНК фага Т4 в качестве матрицы, синтезируют короткие затравки. Все они представляют собой пентарибонуклеотнды с общей последовательностью рррАрСр)»)р)»)р)»)р.
Следовательно, стартовая последовательность, длина которой ограничена пятъю основаниями, содержит два специфичных нуклеотида в начале, в то время как последние три позиции могут быль заняты любым нз оснований. В присутствии полного аппарата репликации эти затравки удлиняются в пепи ДНК. Затравки образуются в специфических сайтах, хотя этн сайты и встречаются часто-вероятно, чаше, чем один на кажлые 2000 оснований, разделяющих стартовые точки фрагментов Оказаки. Возможно, что репликационная вилка минует серию потенциальных затравочных сайгон; вероятно, это диктуется расстоянием, пройденным после последнего собьпия инициации.
Белок гена 41 имеет ОТРазную активность, стимулируемую одноцепочечной ДНК. Связываясь с ней, белок способен перемещаться со скоростью примерно 400 нуклеотидов в секунду. Возможно, что его роль аналогична роли белка ОпаВ бактерии-хозяина и заключается в поиске сайтов, в которых этот белок останавливается и инициирует синтез затравки. Предполагается, что энергию для перемешения обеспечивает гидролиз ОТР. Белок гена 61 необходим в значительно меньших количествах, чем большинство других белков, участвующих в репликации фага Т4. Это препятствовало его изучению. )Требуемое количество этого белка так мало. что первоначально он не был замечен как необходимый компонент; его было достаточно, когда он присутствовал в виде загрязняющей примеси в препарате белка гена 32.) Возможно, что белок гена 61 является праймазой, аналогичной белку )3паО Е. сод.
В клетке, по-видимому, сушествует не более !О молекул белка гена 61. ДНК-полимераза гена 43 обладает обычной 5' — Зчсинтетической активностью, связанной с 3'--5чэкзонуклеазной корректирующей активностью (гл. 32.) Оставшиеся три белка отнесены к «полимеразным вспомогательным белкам». Продукт гена 45 является лимером. Продукты генов 44 и 62 образуют прочный комплекс, который характеризуется ЛТРазной акзивностью н тем, что он увеличивает скорость движения ДНК-полимеразы в 3-4 раза, от 250 до примерно 800 нуклеотндов1с; последнее значение близко к скорости движения ДНК-полимеразы ьч чгяо ( !000 нуклеотидов1с).
Увеличение в скорости не зависит от того, используется одно- или двухцепочечная матрица. В тех случаях, когда ДНК-полнмераза фага Т4 работает на одноцепочечной матрице ДНК, скорость ее движения непостоянна. Фермент быстро передвигается в пределах одноцепочечных областей, однако при прохождении через области, имеющие вторичную структуру, образуемую спарившимнся внутри цепи основаниями, движение его замедляется. Прохождению ДНК-полимеразы через такие участки способствуют вспомогательные белки. Их роль заключается в увеличении скорости реплнкации в «трудных» областях и, следовательно, в поддержании равномерности движения ДНК-полимеразы. Присутствие белков увеличивает сродство ДНК-полимеразы с ДНК, а также ее способность удерживаться на матричной молекуле без диссоциацин.
Возможно, что белки действуют как «зажим», удерживая ДНК-полимеразную субъеднннцу на матрице более прочно, Для такого эффекта необходимо совместное действие всех трех белков. Подобный тип взаимоотношений оставляет открытым вопрос о том, что является компонентом ДНК-полимеразы, а что вспомогательным фактором. До сих пор мы говорили о репликации ДНК, касаясь круга вопросов, связанных с движением репликационной вилки. Наличие мутантов с задержкой нли прекращением синтеза ДНК свидетельствует об участии в ней генов, контролирующих другие функции.
Мутации в четырех из них — 39, 52, 58 и 60 — определяют задержку синтеза ДНК. С помощью комплементационного анализа в системе !и и!гго показано, что продукты ~снов 39 и 52 связываются с другим белком )неизвестной природы) и образуют ком- 429 33. Ферментативный аппарат реплнкацнн ДНК Исходная цепь 3' ~серое с> Новая цепь .попнмерааы э' Исходная цепь плекс из трех субъединиц )51 000, 64000 и !!0000 дальтон). Этот комплекс проявляет активность топоизомеразы П фага Т4.
Существенная роль этого фермента свидетельствует о том, что ДНК фага Т4 не остается в линейной форме, а утрачивает свободные концы. Топоизомераза может быть необходимой для раскручивания ДНК перед репликационной вилкой. Репликационный аппарат фага Т7 Изучение других систем репликации показывает, что в каждой из них присутствуют одни и те же типы активности, хотя обеспечиваться они могут разными способами. Репликапионный аппарат фаса Т7 аналогичен аппарату репликации Е. сой илн фага Т4, хотя, по-видимому, отличается менее сложной организацией. Фас кодирует одну субъединицу ДНК-полимеразы. Вторую субъединицу представляет белок бактерии-хозяина-тиоредоксин. Этот белок состоит из полипептида с мол. массой 12000 дальтон и используется как кофермент в окислительно-восстановительиой реакции при восстановлении рибонуклеотидов.
Его функция в качестве партнера ДНК-полимеразы фага Т7 загадочна; по-видимому, она отличается от той, которую он выполняет в бактерии-хозяине. ДНК-полимераза фага Т7 использует в виде вспомогательного белка продукт фагового гена 4, в котором объединены функции раскручивания двухспиральной матрицы и синтеза РНК-затравки. ДНК-полнмераза вместе с белком гена 4 способна завершить репликацию !и ч)гго, хотя ш ч!чо при удалении РНК-затравки в процесс может также вовлекаться экзонуклеаза.
копируемая фаговым геном 6. Репликационная вилка содержит, по-виднмому, в расчете на одну растущую цепь 10 молекул белка гена 4 н одну молекулу ДНК-полимеразы. Продукт гена 4 гидролизует )ц)ТР свыше того количества, которое используется в качестве субстрата для синтеза РНК. На каждое основание, включаемое в ДНК, может приходиться до четырех дополнительных гндролитических событий. Вероятно, этот гидролиз обеспечивает энергией процесс разделения цепей. Праймазная активность гена 4 используется для синтеза тетрарибонуклеотидных затравок, имеюших почти постоянную последовательность рррАрСРСргр. УзнаваеА мая последовательность в случае реакции синтеза затравки включает предшествующий остаток О.
Последовательность, в которой инициируется синтез затравки, встречается в ДНК фага Т7 примерно один раз на каждые 500 оснований, в то время как длина фрагментов Оказакн колеблется в пределах от 1000 до 6000 оснований. Отсюда следует, что используются только некоторые сайты затравки, Точка переключения синтеза затравки на синтез ДНК не является строго установленной, так как размеры некоторых затравок унеличены до пентарибонуклеотидов.
Проблема линейных репликонов В связи с тем что все известные цолимеразы нуклеиновых кислот способны действовать только в 5'- — 3цнаправлении, возникает проблема синтеза ДНК в конце линейного репликона. Рассмотрим две родительские цепи, изображенные на рис. 33.10. Нижняя цепь может использоваться в качестве матрицы для синтеза дочерней цепи, которая быстро нарашивается вправо до Рис. 33 !О. Рсцлвкация можег удлинить Зцконец вновь сннзезироцанной цепи, но может ди она инициировать синтез 5цконца? конца, где полимераза, по-видимому, отпадает. Однако, для юго чтобы могла синтезироваться комплементарная цепь, в конце верхней цепи в самом последнем ее основании должно произойти затравочное событие.
Мы не знаем, возможно ли образование терминальной затравки. Принято считать, что РНК-полимераза связывается в сайте, расположенном рядом с участком, в котором осуществляется включение основания. Были предложены две гипотезы, объясняющие возможность копирования конца. Во-первых, ДНК может образовывать необычную структуру, например шпильку, что приведет к отсутствию свободного конца. Иная возможность реализуется у Рогатое!от. Показано, что при репликацни ее линейной митохондриальной ДНК образуются поперечные сшнвки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
