Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 193
Текст из файла (страница 193)
Поскольку репликция полностью метилированной ДНК всегда ведет к образованию частично метилированной ДНК )см, рис. 34.1 и рис. 31.15), узнавание частично метилированных сайтов является, вероятно, обычным способом действия метилазы ш ч)чо. Фермент рестрикции не связывается с метилированными сайтами-мишенями. Большинство рестрикционных ферментов типа П разрезают ДНК в неметилированном сайте-мишени.
В кажлой цепи ДНК разрезается одна связь; разрезание может производиться последовательно. Некоторые ферменты вносят ступенчатые разрезы, другие вызывают образова- ние тупых концов )гл. !9). Ферменты, разрезающие ДНК с одной стороны вблизи от сайта узнавания, относя~ к одному полклассу. Вероя~но, по мере изучения механизмов действия ферментов будут обнаружены и лругие подклассы.
Ко второму классу активностей, характеризующих систему рестрикции и модификации отнесены активности ферментов типа 1 и П1. Эти ферменты представляют собой мультимеры и выполняют в клетке как энлонуклеотическую, так и метилируюшую функции. Механизмы их действия отличны лруг от цруга и от механизма действия ферментов типа и. Точно не известно, у какой части бактерий функционируют системы типа 1 или Ш, однако очевидно, что они менее распространены, чем система типа и.
К ферментам типа ! относятся ЕсоК и ЕсоВ, выделенные из штаммов Е. сай К и В. Рис. 34.2 дает представление о ферментах рестрикции и модификации типа 1, состоящих из трех разных субъединиц. Субъединица й ответственна за рестрикцию, субъелиница М вЂ” за метилирование, а субъединица Б — за узнавание сайта-мншени ДНК. После того как сайт-мишень узнается Б-субъединицей, происходит связывание фермента с ДНК, а затем либо ее рестрикция, либо модификация; активности субъединиц й и М являются взаимоисключаюшими. Каждая субьединица кодируется одним геном. Они названы ЪИ, )АМ и Ьа45 соотве.гсгвенно. Мутанты ЬъИ имеют фенотип г ш; они не способны рестрицировать ДНК, однако могут модифицировать ее.
Мутанты )ааао являются по фенотипу г ш, т.е. не модифицируют и не рестрицируют ДНК. Мутации в )ала)М предотвращают как рестрикцию, так и модификацию. Слеловательно, М- субъединица включается в функционирование и-субъединицы. Вероятно, это необходимо для тою, чтобы мутанты АМ были по феиотипу г ш, а не г" гп, поскольку мутанты с таким фенотипом, по-видимому, нежизнеспособны (рестрикционная активность вызывала бы деградацию собственной немолифицированной ДНК). Гены, кодируюшие ферменты ЕсоК и ЕсоВ, аллельны.
Узнаваемые ими последовательности различны, но путем конструирования диплоидов из соответствующих мутантов можно показать, что 8-субъелипица одного штамма направляет активности и- и М-субъединицы другого бактериального штамма. Следовательно, стадия узнавания Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений ьве н ьке м Ьет! Б дни эзрмьжкрзачрчрчрързачрьрьрчачтхзрчрртхххзрчачтхт мрнк Белки 1звк ' ~*62К г Фермент рллтрикции и модификации Рцс.
34 2 Полифункцнональные ферменты типа 1 содержат раз личные субъелиницы лля рестрикции„модификации и узнавания не зависит от сменяющих ее событий разрезания илн метилирования. Фермент ЕсоК имеет мол. массу около 400000. Он содержит две копии й-субъелиницы по 135000 дальтон каждая, две копии М-субъединицы (62000 дальтон) и одну копию 5-субъединицы с мол. массой 55000. Фермент ЕсоВ состоит из субъединиц такого же размера, однако они могут быть представлены в других молярных соотношениях.
Субъединицы М и 5 в соотношении 1:! формируют комплекс, который проявляет функцию метилировання независимо от функции рестрикции. Это естественно, поскольку три гена локализуются в опероне в следующем порядке: Р! — (тхт(й-- Р2 — (тхт(М вЂ” (тзт(5„где Р! н Р2 — независимые промоторы (см. рис. 34.2).
Таким образом, гены йж!М и (тзт(5 могут экспрессироваться независимо от )тхт(й. Сайты узнавания ферментов ЕсоВ н ЕсоК вЂ” это структуры, состоящие из двух частей. В обоих случаях первая часть представлена специфической последовательностью из трех пар оснований, отделенной у фермента ЕсоВ восемью парами, а у ЕсоК вЂ” шестью парами оснований от специфической последовательности в четыре нуклеотидные пары.
Расстояние между двумя частями сайта узнавания указывает на то, что обе онн находятся на одной стороне ДНК; последовательность промежуточной области, по-видимому, важной роли не играет. Заметим, что оба сайта узнавания несимметричны. Однако каждый из ннх действительно несет на каждой из! цепей цо одному аленину для метилирования, как поквзазтзо звездочками в последовательности узнавания ферментов ЕсоВ. Т а А Н )х( ) ( Н Н Н )х( Н Т а С т А С Т )к( (к( )к( ('( )к( (т( )к( тч( А С О А Будет ли данная ДНК разрезана илн модифицирована, определяется состоянием сайта-мишенн (рис. 34.3).
Если сайт-мншень полностью метилирован, фермент может связаться с ним, но затем диссоциировать без какого-то дальнейпзего действия. Если мишень частично метилирована, фермент метилирует неметилированную цепь; благодаря этому сохраняется состояние метилирования в ДНК хозяина. Если мишень не метилирована, ее узнавание способствует реакции разрезания. Группы для метилирования обеспечиваются кофактором 5-аденозилметионином (5АМ), который в ходе реакции превращается в 5-аденозилгомоцистеин (5АН).
Связывание 5АМ с М-субъединицей необходимо для узнавания ДНК субъединицей 5. Мутации в !тж!М могут привести к неспособности связываться с 5АМ. На начальной стадии реакпии 5АМ действует как аллостерическнй эффектор, т.е, изменяет конформацию белка, позволяя ему связаться с ДНК. Конформационное изменение захватывает 5-субъединицу, о чем свндетелъствуют мутации в (тхт(5, предотвращающие ее переход в активную форму. После связывания с ДНК следует реакция с АТР. Если фермент связался с полностью метилированным сайтом, наличие АТР ведет к отделению его от ДНК. В неметилированном сайте АТР превращает фермент в форму, способную осуществить разрезание.
Обнаружение мутаций в (тЫ)1, предотвращающих АТР-индуцируемое конформационное изменение, свидетельствует о том, что это зависит от й-субъединнцы. Для разрезания ДНК необходим гидролиз АТР. 5АМ освобождается от фермента до того, как происходит реакция разрезания. Роль АТР в случае частично метилированного субстрата неясна; метилирование частично метилированной ДНК может происходить н без АТР, но реакция идет более эффективно в его присутствии.
Для сайтов узнавания н разрезания ферментов типа 1 характерны необычные взаимоотношения. Сайт )зазгезання расположен на расстоянии более 1000 пар оснований от сайта узнавания: Разрезайие производится не в специфическойт последовательности, но и не в совершенно случайном сайте; имеются области, предпочтительные для событий разрезания. (Различие между сайтами узнавания и разрезания состоит в том, что сайты узнавания нельзя определить по такому характерному признаку, как разорванные концы ДНК; сайты-мишени идентифицируются благоцаря их модификации при метнлировании, а также при локализации мутаций, препятствующих узнаванию.) Реакция разрезания осуцгеатвлается.. в.
две..ступени, Сначала разрезается одна цепь ДНК, а затсяй Вялом раз)уезаетбя другая. В областях,"прилегающих с каждойстороны к сайту разрезания, может иметь место экзонуклеотическая деградация, Происходит эффективный гидролиз АТР, роль которого еще не выяснена. Каким образом фермент узнает один сайт, а разрезает другой, достаточно удаленный? Важно отметить, что белок никогда не отделяется от молекулы ДНК, с которой он первоначально связался. Если фермент инкубировать со смесью модифицированной и немодифнцнрованной ДНК, он предпочтительно разрезает немоднфнцированную ДНК.
Следовательно, узнавая сайт связывания, белок не отделяется от неметилированной ДНК для того чтобы найти сайт разрезания. Существуют две альтернативные модели, объясняющие взаимосвязь между сайтами узнавания и разрезания: в соответствии с одной из них движется фермент, согласно другой модели, перемещается ДНК. Предполагаемые схемы этих процессов представлены на рис.
34.4. Если движется фермент, то его перемещение вдоль ДНК будет продолжаться до тех пор, пока он не сделает выбор сайта разрезания. Если же движется ДНК, то фермент остается прикрепленным в сайте узнавания, а ДНК протаскивается через второй сайт связывания на ферменте, и это продолжается до тех пор, пока фермент не достигает области разрезания (пока не- Часть 1Х.
Сохранение ДНК в ряду поколений Р1 АОАСС ТСТОО Р15 САОСАО ОТСОТС снэ о а Рапитепьский лайт АПАСС тстсэ АСАСС ТСТ66 Риа. 143. Ферменты типа И! содержат две субъединнцы. Узнавание и матнлнрование, осуществляемые субъелннипей МЯ, происходят в сайте-мищепи; событие Рестрикции может происходить в соседнем сайте, находящемся в контакте с субъединицей и. це МБ. Рестрикционное разрезание происходит на расстоянии 24 — 2б пар от сайта узнавания с одной его стороны, что, вероятно, обусловлено тем, что достаточно большие размеры фермента не позволяют субъедннице рестрикции контактировать с ДНК в этой же точке (рис. 34.5). Рестрикция включает ступенчатые разрезы, отделенные друг от друга 2 — 4 основаниями.
Ферменты метилируют адениновые остатки, однако сайты-мишени Р! и Р(5 имеют загадочное свойство: они могут быль метилированы ьщлько на одной цепи. Ниже представлены последовательности сайтов Возникает вопрос: как сохраняется состояние метилнрования? На рис, 34.6 показано, что в процессе репликации возникают два типа сайтов. Одна реплика содержит исходную метилированную цепь и фактически неотличима от родительской. Другая реплика полностью не метили- рована и поэтому представляет собой мишень либо для рестрикции, либо для модификации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
