Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 196
Текст из файла (страница 196)
Данная точка зрения получила подтверждение при выделении других тес-мутантов с нарушением (хотя и в меньшей степени) и репарации, и рекомбинации (см. табл. 34.2). Компоненты, включаемые в рекомбинационную репарацию, перекрываются с компонентами, участвующими в рекомбинации, но не гюлностыо идентичны им (некоторые мутации повреждают только одну из двух активностей). Белок КесА функционирует при обмене цепями между молекулами ДНК. Это главная активность в процессе рекомбинации (гл. 25), родственная предполагаемому одноцепочечному обмену в рекомбинационной репарации. Свойсчва двойных мутантов позволяюч предполагать существование двух Кес-путей.
Чтобы проверить, принадлежат ли два гена с родственными функциями одному и тому же илн различным путям, сравнивали фенотипы одиночных мутантов с фенотипами двойных мутантов. Если чены принадлежат к одному и тому же пучи, фенотип двойного мутанта не будет отличаться от фенотипа одиночного мутанта. Если гены контролируют разные пути, у двойного мутанта будут утрачены они оба. Согласно этому критерию, один гес-путь включает гены гесВС, другой — ген. Гены гесВС кодируют две субъединицы экзонуклеазы Ч, чье действие ограничено другим компонентом пути.
(В клетках гесА-мутаитов фермент вызывает чрезмерную деградацию ДНК.) Функция гена ген неизвестна. Благодаря эффектам мутаций на рекомбинационную репарацию илн рекомбинацию были идентифицированы и другие покусы тес. Некоторые из них супрессируют определенные тес-мутации. Как и в случае дополнительных покусов иги их не удалось связать с какими-то продуктами или функциями.
Обозначения этих генов основаны на фенотипах мутантов; однако в некоторых случаях мутация, выделенная при одних условиях и названная как игг,может оказаться илентичной мутации, выделенной при других условиях и отнесенной к локусу тес. Это очень важный факт. Мы ие можем еше точно определить, сколько функций принадлежит кажлому из путей или каким образом они взаимодействуют. Механизмы игг и гес не могут быть совершенно независимыми, так как лля мутантов исг характерна пониженная эффективность рекомбинационной репарации.
Можно ожидать выявления ряда нуклеаз, полимераз и других ферментов, составляющих репарирующие системы, которые могут быль частично перекрываюшимися (или в которых один фермент, обычно используемый для обеспечения какой-то функции, может быть заменен ферментом, принадлежащим другому пути). Прямое участие КесА-белка в рекомбинационной репарации представляет только одну из его активностей. Этот необычный белок имеет также другую, весьма важную функцию.
Он является протеазой, активируемой УФ- облучением (или другими воздействиями, блокирующими репликацию). Протеазная активносп ответственна за индукцию экспрессии многих генов, чьн продукты имеюч и репарируюшие функции. Среди них, например, можно назвать репарацию длинными последовательностями; следовательно, белок КесА необходим для индукции этой эксцизионной репарации и для участия в работе рекомбинационной репарации. Такая двойная роль белка КесА затрулняет выяснение вопроса о том, чем обусловлено нарушение репарации в мутантных клетках гесА.
Связано ли это с утратой функции белка КесА в обмене между цепями ДНК или какой-то другой функции, индукция которой зависит от протеазной активности этого белка? 34. Системы защиты ДНК 441 ЯО5-репарцпия Многие воздействия, которые повреждают ДНК или ингибируют ее репликацию у Е сой, индуцируют серию фенотипических изменений, получивших название эОЯ- ответа. Начало такого ответа определяется взаимодействием белка КесА с репрессором (.ехА.
Повреждение может быть вызвано УФ-облучением (наиболее изученный случай), возникновением поперечных сшивок или алкилирующими агентами. Подавление репликапии различными способами, включая тиминовое голодание, добавление ядов или возникновение мутаций в некоторых из генов дла имеют тот же эффект. Ответ клетки, выражающийся в увеличенной способности репарировать поврежденную ДНК, достигается путем индукции синтеза компонентов системы эксцизионной репарации длинных последовательностей и Кес-зависимой репарации. Наряду с индукцией происходит подавление клеточного деления. Лизогенизирующие профаги могут быть индуцированы.
Ответ клетки на повреждающее воздействие начинается с активации протеазной активности белка КесА. О взаимосвязи между повреждающим событием и внезапным изменением в КесА-активности нам известно немного. Поскольку оОВ-ответ способны индуцировать разные повреждающие агенты, можно предположить, что белок КесА стимулируется каким-то общим промежуточным продуктом в метаболизме ДНК. Индуцируюшим сигналом может служить небольшая молекула, освобождаемая из ДНК, или какая-то структура, образуемая в самой ДНК. В системе (п чйго протеазная активность белка КесА требует присутствия одноцепочечной ДНК и АТР. Таким образом, активирующим сигналом может быть присутствие одноцепочечной области в сайте повреждения.
Независимо от того, какую форму имеет сигнал, его взаимодействие с белком КесА происходит очень быстро: БОК-ответ проявляется через несколько минут после повреждающей обработки. Активируясь, КесА-протеаза разрезает белок-репрессор, кодируемый геном (ехА. Белок 1.ехА относительно стабилен в необработанных клетках, где он функционирует как репрессор многих оперонов.
Протеолитическое разрезание репрессора коорлинированно индуцирует все эти опероны. Ганы, представляющие мишени для 1.ехА-репрессии, включают многие репарационные функции, из которых в настоящее время идентифицированы лишь некоторые. Путем слияния случайных оперонов с геном (асУ была разработана система, позволяющая определять (.ехА-зависимость генов на основании увеличения продукции ))-галактозидазы после обработки клеток митомицином С.
Было идентифицировано по крайней мере пять ЬехА-зависимых генов; они были названы г(1и (от англ. г(атаде Гайлис(Ые). Ранее известные гены, которые участвуют в оОБ-ответе в результате активации их продуктов, включают гесА, !ехА, иггА, иегВ, иьчиС и )и'пА. Некоторые из ЗОБ-генов активны только в обработанных клетках; другие активны в необработанных, но уровень их экспрессии увеличивается при разрезании белка (.ехА. Для гена ивгВ, который представляет собой компонент системы эксцизионной репарации, имеются два промотора; один функционирует независимо от (.ехА, другой подвержен его контролю, Вот почему после разрезания репрессора (.ехА ген может экспрессироваться при использовании обоих промоторов.
Очистка белка 1.ехА позволила охарактеризовать его действие (п чйго. Он репрессируез гены-мишени, связываясь с последовательностью ДНК длиной около 20 пар оснований, названной БОЯ-блоком. Эта последовательность симметрична, и ее копия представлена в каждом покусе-мишени. БОБ-блоки различных покусов не идентичны, но во всех случаях представлены последовательностями с восемью абсолютно сохраняемыми позициями.
Подобно другим операторам, БОБ-блоки перекрываются с соответствующими промоторами. КесА и 1ехА являются взаимными мишенями в БОЯ- цикле. КесА разрезает 1.ехА, который в свою очередь репрессирует КесА. БОЯ-ответ вызывает амплификацию обоих белков. Рис. 34.10 иллюстрирует происходящие события; их результаты не столь противоречивы, как может показаться на первый взгляд. Увеличение экспрессии белка КесА, по-видимому, необходимо для выполнения его роли в рекомбинационной репарации.
Это означает, что в клетке имеется достаточное количество протеазы для разрезания всего дополнительного белка (.ехА, что необходимо для предотвращения повторной репрессии генов-мишеней. Однако основное значение этого цикла для клетки может заключаться в способности быстро восстанавливать обычное состояние.
При прекращении индуцирующего сигнала белок КесА теряет свою протеазную активность. В этот момент ген (ехА имеет высокий уровень экспрессии; в отсутствие КесА-протеазы белки 1.ехА быстро накапливаются в неразрезанной форме и выключают БОБ-геньь Этим можно объяснить легкую обратимость оОВ-ответа.
Протеаза КесА действует и на некоторые другие репрессорные белки, например репрессоры отлельных профагов (именно на примере репрессора профага лямбда и была открыта протеазная активность). Это объясняет, почему фаг лямбда индуцируется ультрафиолетовым облучением: КесА разрезает лизогенный репрессор, и фаг вступает в литический цикл развития. Указанная реакция не является клеточным БОК-ответом; она свидетельствует о способности профага узнавать, что клетка находится в опасности, и обеспечивать выживаемость вступлением в литический цикл.
В этом смысле индукции профага зависит от клеточной системы, поскольку она реагирует на тот же самый си~над (активацию КесА- белка). Протеаза КесА разрезает все доступные ее действию белки в А!а-О1у-последовательности в середине полипептидной цепи. Мутанты типа (ехА (1пб ) индуцировать нельзя; один из них содержит замещающую последовательность А1а-Азр. С каждой стороны от дипептида имеется лишь ограниченная гомология, что позволяет предполагать, что третичная структура белка может играть важную роль в узнавании мишени. Две активности белка КесА проявляются относительно независимо. Мутация гесА441 вызывает оОБ-ответ без индуцирующей обработки, вероятно, потому, что протеаза спонтанно активна.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
