Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 199
Текст из файла (страница 199)
Данные, полученные на клетках дрожжей, согласуются с моделью двухцспочечного разрыва: инициация сопряжена с получением генетической информации. Эта модель предусматривает существование родства между сайтами, участвующими в событии генетического обмена, и подтверждается данными, полученными при анализе систем рекомбинации грибов. О правомочности этой модели свидетельствует тот факт, что у дрожжей двухцепочсчные разрывы участвуют в определенных рекомбинационных событиях. Прн введении плазмиды с двухдепочечным разрывом в клетки дрожжей наблюдается стимуляция рекомбинации и, кроме того, могут образовываться продукты рекомбинации с рспарированной брешью. Модель двухцепочечного разрыва не умаляет важности образования гетеродуплексной ДНК, которая вероятно представляет собой единственный реальный способ взаимодействия двух дуплексных молекул. Однако, возлагая ответственность за инициацию рекомбинации на двухцепочечные разрывы, мы должны изменить наши представления о способности клетки манипулировать с ДНК.
На первый взгляд участие двухцепочечных разрывов в инициации рекомбинации кажется удивительным. Ведь 35. Восстановление и рекомбинация ДНК 447 Датицапоьатныа «опьцааыа МОЛЕКУЛЫ ДНК апариааютс 11 (! !! 11 !! Г ( / т !! ! / т / Г !! ! 1! ! Рацнпроннап РанОмбинацил 1 ~\ // Г/ / 1 11 !! Ц // / (! !! !! !! Димтрный пролтнт Димерное кольцо Гомалотиьные Оайты епаритмютел Раципрокнап рекомбинации Рнс 35 4 Реципрокная рехомбинапяя между гомологичнымн друхпепочечнымя кольцевыми молекулами приводит к образо- поперечный разрез молекулы ДНК приводит к необратимым последствиям.
Согласно модели одноцепочечного обмена ни на одной из стадий не может быть потеряна никакая информация. В соответствии с моделью двухцепочечною разрыва первый же разрыв немедленно сопровождается потерей информации; при этом фатальной может оказаться любая ошибка прн восстановлении. С другой стороны, именно способность восстанавливать утраченную информацию путем ресинтеза ее с использованием друюго дуплекса обеспечивает основную систему безопасности для кле~ки. Выделение промежуточных продуктов рекомбинации Свойства кольцевых молекул ДНК могут быть использованы при разработке подходов к выделению промежуточных рекомбинационных структур. До сих пор мы рассматривали рекомбинирующие двухцепочечные ДНК как линейные молекулы, хотя многие геномы (особенно вирусные и плазмидные) имеют кольцевую структуру.
На рис. 35.4 изображены последствия реципрокной рекомбинации между томологичными сайтами на двух кольцевых молекулах ДНК. Увеличенная часть рисунка показывает, что в месте соединения эта структура не отличается от той, которая изображена на рис. 35.2, за исключением того, что концы каждой двухцепочечной родительской ДНК соединены. Этот факт имеет важные топологические последствия. Разделение такой структуры при рекомбинации ведет к образованию димерного кольца, содержащего две исходные родительские последовательности, соединенные по типу «голова к хвостур.
Какое это имеет значение для жизненного цикла кольцевых ДНК? Если они вступают в рекомбннацию, исходные (мономерные) кольцевые геномы могут сохраниться тодько благодаря парным рекомбинационным событиям. Одно реципрокное рекомбинационное событие всегда порождает димер, изображенный на рис.
35.4. Та- вению димерного кольца. Промежуточный продукт имеет структуру, напоминающую по форме пифру восемь. кой димер может восстановить мономерную структуру благодаря второму рекомбинационному событию, вовлекающему любую пару гомологичных последовательностей (рис. 35.5). Поэтому в любой популяции кольцевых гсномов в момент рекомбинации можно обнаружить мультимерные кольца. В результате рекомбинации кольцевых молекул ДНК образуется структура, имеющая форму восьмерки (рис. 35.4). Димерные молекулы такой формы были обнаружены у нескольких фагов в инфицированных клетках, а также в популяции плазмидной ДНК у дрожжей.
Однако внешний вид этих структур не позволяет с определенностью идентифицировать их как рекомбинационные ин- о Монамерные кольца Рнс. 35 5. Прн репнпрокной рехомбипапяи между гомологичнымя последовательностями димерньп колец образуютсл мономерные кольца. Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений Рпе 35.6. Разрезание промежуточной структуры, имеющей форму восьмерки в гомологичных сайтах на каждом кольце приводят к образованию ебйподобной структуры, у которой' термедиаты; например, вид восьмерки могут иметь взаимосцепленные (батенаньз~ мономерные кольца. Природу «восьмеркйзз можно определить, если подействовать на нее рестрикционным ферментом, разрезающим каждое мономерное кольцо только в одном сайте.
Если две части молекулы, имеющей вид восьмерки, не связаны ковалентно, они разделятся. Если же «восьмерка»-результат рекомбинации, ее разрезание приведет к появлению структуры, в которой родительские молекулы удерживаются вместе областью гетеродуплексной ДНК в точке слияния. Разрезанная молекула имеет четыре о~не~аления, причем каждая пара ответвлений соответствует каждому из исходных мономерных колею В разрезанной форме молекула получила название с)ггз структуры, поскольку она напоминает греческую букву (. Ее ммйкрофотография представлена на рис. 35.6 вместе с поясняющей схемой. Четыре ответвления двухцепочечных ДНК соединены областью, в которой гетеродуплексные сегменты были разорваны на составляющие их отдельные цепи (по-видимому, в результате приготовления препарата для электронной микроскопии).
Такая структура точно соответствует предсказанной (рис. 35.2 и 35А); ее выделение является прямым доказательством существования гетеродуплексной ДНК гп о(чо. Оггзструктуры найдены только в клетках дикого типа, но не обнаружены в мутантах гесА . Следовательно, их существование коррелирует со способностью клетки к генетической рекомбинации. Этот факт еще раз подтверждает, что с)г1-структуры не случайные примеси, а имеют прямое отношение к генетической рекомбинации. четыре двухпепочечных отростка оегаютев объединенными в еайте обмена цепи.
)Еготографгга любезно прелоетавлена ЬХ Нгем|ег.) Данные наблюдения можно использовать для разработки методов очистки рекомбинационных ферментов. Бесклеточные экстракты проверяют на способность формировать димерные молекулы из мономерных колец. Экстракты из клеток дикого типа выполняют эту реакцию; в них образуются молекулы типа восьмерки, которые далее могут быть разрезаны с образованием с)ггзструктур.
Экстракты из клеток гесА в этом отношении неактивны. КесА-систему можно фракционировать и использовать компоненты в комплементационных экспериментах, подобно тому как это делается для изучения репликации ДНК (гл. 33). Обмен между ценями„ осуществляемый при участии белка КесЛ К сожалению, о генетическом аппарате, осуществляющем общую рекомбинацию, известно мало. Охарактеризованы ферменты, участвующие в каких-то специализированных рекомбинационных событиях; описаны некоторые связанные с ними топологические изменения.
Однако все это лишь доказало сложность изучения гомологичной рекомбинации. Другой подход к исследованию свойств ферментов, вовлекаемых в генетическую рекомбинацию,— получение тес -мутаций в их генах. Малочисленность известных продуктов свидетельствует о том, что до сих пор этот подход использовали главным образом для получения 35. Восстановление и рекомбинация ДНК 449 данных о способности белка КесА участвовать в обмене цепей ДНК. Точно неизвестно, как ферментативные активности КесА связаны с рекомбннацией )и «(«о, однако показано, что они участвуют в нескольких реакциях, включенных в рекомбинационный механизм.
Мы уже упоминали, что для проявления протеазной активности КесА-белка необходимы одноцепочечная ДНК н АТР (гл. 34). Те же субстраты требуются для осуществления его манипуляций с молекулами ДНК, Белок КесА стимулирует спаривание оснований между отдельной цепью ДНК и комплементарной ей цепью в суперспнральной кольцевой молекуле. Одна цепь атакует кольцо, вытесняет исходную и спаривается с комплементарной цепью, в результате чего образуется О-петля. (рнс. 35.7, верхний рлд). Эта реакция получила название поглощения или ассимиляции одной цени. Процесс ассимиляции одной цепи родствен образованию гетеродуплекса, модель которого представлена на рнс. 35.2.
Райница состоит в том, что рекомбннационная модель предполагает два вторжения. В каждом случае одна цепь реципрокно вытесняет своего гомолога в двухцепочечной молекуле- партнере. Белок КесА способен связываться как с одноцепочечной ДНК (действне стимулируется АТР), так и с двухцепочечной (действне требует присутствия АТР). Реакция ассимиляции требует гидролиза АТР. Ассимиляция происходит в оптимальном режиме при наличии одного мономера АТР на каждые 5 — Ю нукдеотидов одноцепочечной ДНК. Итак, реакция осуществляется при связывании КесА-белка с одноцепочечной ДНК. Нам еше непонятна последовательность событий, предшествующих образованию О-петли, однако можно предположить, что КесА-белок сначала связывается с одноцепочечной, а затем с двухцепочечной ДНК в поисках комплементарной одноцепочечной области.
Основной вопрос состоит в том, каким образом происходит плавление двухцепо- Ам ующая оанненна цене Замещаемая евое ая цаца Прояуне ю ллв ыы лл- Ъ/ Рнс, 35 7 йесА-белок стимулирует ассоциацию атакующих одиночных цепей молекулы ДНК ло тех пор, пока одна нз взаимодействующих цепей имеет свободный конец. зо- поз О. "Э чечной ДНК, позволяющее вторгающейся цепи найти комплементарный участок.
В реакции образования О-петли вытеснение гомологичной кольцевой цепи происходит частично; структура ковалентно замкнутого двухцепочечного кольца может служить топологической помехой распространению реакции. Реакция будет более эффективной, если поставить структуры двух- и одноцепочечной молекул в обратном порядке. Кольцевая одноцепочечная молекула может взаимодействовать с гомологнчной двухцепочечной, вытесняя полностью одну цепь.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
