Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 200
Текст из файла (страница 200)
Схема реакции представлена на рис. 35.7 (средний рлд). Она начинается в одном конце молекулы и распространяется к другому ее концу, образуя гетеродуплекс длиной до нескольких тысяч пар оснований. Такая пара субстратов была использована для выяснения некоторых вопросов, касающихся механизмов реакции. Происходит ли она в каком-то определенном направлении? На рис. 35.8 показано, что это можно проверить, используя линейную одноцепочечную ДНК, которая комплементарна одной цепи только в одном конце.
Такой субстрат получают при добавлении чужеродного фрагмента ДНК к одному концу линейной молекулы. Если фрагмент локализован в 5'-конце комплементарной цепи, т.е. той, которая должна спариваться с вторгающейся цепью, реакция протекает вполне нормально (рис.
35.8, верхний рлд). Однако, если чужеродную ДНК содержит 3'-конец комплементарной цепи, реакция не происходит (рис. 35.8, средний рлд). Следовательно, ассимиляция одной цепи может происходить только в фиксированном направлении, от 3'-конца комплементарной цепи к 5'-концу, илн (относительно вторгающейся цепи) от 5'-конца к 3'-концу. Что происходит, если две последовательности только частично комплементарны н не соответствуют одна другой полностью? Какая степень дивергенцин может допускаться прн работе КесА-белка? В том случае, когда чу- Часть !Х. Сохранение ДНК в ряду поколений 450 тялхя лхяяяяяяввл з' / ' яяяяясыьяяялляяяллчя — + ем цни нчг ч з' лмчяялхлло)ечяяяяяяяожм рнс.
35,8 Белок КесА способен стимулировать ассимиляцию кольцевой одиночной цепи молекулы ДНК только в том случке, если существует комплементврный Зьконец, с которым одиноч- жеродная ДНК внедрена в центральную часть двойной цепи ДНК (рис. 35.8, нижний рлд), реакция ассимиляции цепи останавливается на границе между ними. Следовательно, ес продолжение, как и инициация, зависит от спаривания комплементарных оснований. Однако ассимиляция цепи может развиваться при умеренной степени несоответствия цепей. Например, ДНК фатов И и М13 имеют примерно 97% гомологии и могут вместе подвергаться ассимиляции цепи.
В то же время фаги фХ174 и О4, ДНК которых имеет 70% гомологни, не могут вступать в эту реакцию. Максимум допустимой дивергенцни еше не установлен. Белок КесА и условия рекомбинации Мы знаем, что белок КесА необходим для того, чтобы инициировать ассимиляцию одной цепи, однако существование спонтанной миграции ветвей ставит вопрос о том, требуется ли этот белок впоследствии. В присутствии белка 88В (связываюшегося с одной цепью) КесА- белок необходим для продолжения реакции, а также инициации образования гетеродуплексной ДНК.
Для расширения реакции требуется также гидролиз АТР. В основе механизма активации КесА-белка, стимулирующего миграцию ветви, лежит его способность формировать нити. Этот белок может образовывать длинные нити с одноцепочечной ДНК. В присутствии нуклеотидакофактора он способен полимеризоваться сам по себе или включать в нити двухцепочечные ДНК.
Такие нити по длине превышают исходную молекулу ДНК, что, возможно, свидетельствует о ее раскручивании. Нити из КесА-молекул не образуются в присутствии АТР, однако могут сформироваться в присутствии негидролизуемых аналогов. Вероятно, молекулы КесА-белка способствуют расширению реакции ассимиляции цепи путем кооперативного связывания с ДНК с образованием структуры, родственной нити.
Такая структура может быть разрушена при гидролизе АТР. Эта модель объясняет требования реак- нвя цепь может спврнввться. Если в составе ДНК присутствует чужеродная последовательность, реакция ассимиляции остана- вливается в конце комплементарного участка. цин в отношении стехиометрии между КесА-белком и одноцепочечной ДНК. Присутствие белка БЯВ стимулирует как ассимиляцию одной цепи, так и образование нитей, возможно, посредством кооперирования с КесА-белком и создания соответствующего остова для гетеродуплексной ДНК.
Ассимиляция одной цени требует наличия свободного конца ДНК. Как показывает рис. 35.7, свободный конец может находиться на атакующей цепи (верхний рлд) или на двухцепочечной молекуле (гредний ряд). Если обе молекулы кольцевые, двухцепочсчное кольцо должно иметь разрыв цепи, которая должна быть замещена (нпэкний рлд). Необходимость в свободном конце может отражать свойство КесА-белка или обусловливаться топологнческими помехами. Отдельная цепь со свободным концом будет закручиваться вокруг комплементарной ей цепи, но, если свободный конец отсутствует, молекулы довольно быстро прекратят дальнейшее спаривание. Если одноцепочечная молекула взаимодействует с двухцепочечной, происходит раскручивание дуплекса в области рекомбинации. Образующийся участок гетеро- дуплексной ДНК может даже не иметь традиционную форму двойной спирали.
Он может состоять из двух цепей, связанных друг с пру~ ом бок о бок. Область ~ако~о типа получила название области паранемного соединения (по сравнению с классическим плектоиемным взаимодействием цепей в двойной спирали). Паранемное соединение нестабильно. Дальнейший ход реакции требует его перехода в форму двойной спирали.
Это событие эквивалентно удалению отрицательных сверхвитков и требует участия топоизомеразы 1. Топоизомераза, по-видимому, осушествляет раскручивание)закручивание путем введения временных разрывов, которые позволяют одной цепи вращаться вокруг другой. Однако рекомбинация без исходных разрывов цепей обнаружена и между неспаренными или перекресно спаренными цепямн (см, рнс, 35.2), и это запутывает и без того сложный вопрос об участии топоизомераз в рекомбинационном процессе. и тл 35. Восстановление и рекомбинация ДНК 451 т.
— — — — — -т ммкет рессматрнватесн в овнов плсскостн после вопускаемото времен н~ сы структ Важность топологии молекул доказывается способностью одноцепочечного кольца атаковать ковалентно замкнутое суперспиральное двухцепочечное кольцо только в присутствии топоизомеразы Е По-видимому, топонзомераза решает проблему раскручивания (повторного закручивания), производя временные разрезы, которые устраняют необходимость в свободном конце. Этот факт свидетельствует о том, что рекомбинация может происходить при неспаренности или перекрестной спаренности без первичных разрывов цепей, показанных на рис. 35.2, Все обсуждавшиеся до сих пор реакции представляют только часть потенциального рекомбинационного события: атаку одной цепью двухцепочечной молекулы. При участии КесА-белка мокнут взаимодействовать и две двухцепочечные молекулы при условии, что одна из них содержит одноцепочечную область по крайней мере из 50 оснований.
Такая область может иметь форму хвоста на линейной молекуле или бреши в кольцевой молекуле. Реакция между частично двухцепочечной и полностью двухцепочечной молекулами ведет к обмену цепями (рис. 35.9), Ассимиляция начинается в одном конце линейной молекулы„гле атакующая цепь вытесняет своего гомолога в двойной цепи обычным способом. Когда реакция достигает области, в которой обе молекулы двухцепочечные, атакующая цепь не находит пары в своем партнере, который спаривается с другой вытесненной цепью.
На этой стадии молекула имеет структуру, которая неотличима от рекомбинационного места стыковки, изображенного на рис. 35.2. Если взаимодействующие молекулы кольцевые, продукт может выглядеть как сЫ-структура. Выделение таких продуктов реакции, стимулируемых (п у(гго белком КесА, демонстрирует способность этого белка обеспечивать реципрокный перенос цепей.
Для нормального функционирования белка КесА необходимо, чтобы в одной из взаимодействуюших молекул ДНК имелась одноцепочечная область. Каким образом происходит ее образование 1п угкод Одна из гипотез допускает ограниченную деградацию одной цепи ДНК, другая-сун~ествование какой-то рекомбинационной активности, раскручиваюшей ДНК. Вполне вероятно, что в этот процесс может вовлекаться продукт КесВС. В присутствии ББВ-белка этот фермент, исходно идентифицированный как сильно действующая нуклеаза, также способен осушествлять раскручивание ДНК с образованием одноцепочечных областей.
Белок, напоминающий по своим свойствам КесА, был выделен из клеток гриба (тзгйидо таут(тж Этот белок (Кес!) способен приводить гомологичные молекулы двухцепочечной ДНК в состояние синапсиса тем же (зависящим от одной цепи) способом, что и белок КесА. В присутствии топоизомеразы 1 типа молекулы ДНК, находящиеся в состоянии синапса, могут быть связаны. До сих пор мы обсуждали действие КесА-белка в контексте независимой последовательности ДНК.
Однако существуют горячие точки, которые стимулируют рекомбинационную КесА-систему. К их открытию у фага лямбда исследователи пришли до некоторой степени окольным путем. Созревание ДНК фага лямбда требует образования конкатеме ных л. Обычно их появление связано с изменением в способе репликации, от первоначального типа с О-структурой к типу «катящегося кольца». Хвост катящегося кольца и обеспечивает конкатемерную ДНК.
Переключение с одного способа репликацни на другой требует участия продуктов геИ- и дат-генов фага лямбда, вовлекаемых также в общую рекомбинацию фаговой ДНК. Роль бай-продукта заключается в подавлении действия экзонуклеазы Ч (продукта КесВС), которая предотвращает переход й-молекул в катящиеся кольца, В случае инфекции фагами гет( дале ДНК лямбда не только остается в ()-форме, но и не способна к рекомбинации.
Чтобы обеспечить соответствующий субстрат для созревания фага, в резуль~ате рекомбинации между кольцами-мономерами должны образовываться кольцадимеры (рис. 35.4). Поскольку рекомбинационная функция, кодируемая фагом, отсутствует, это событие полностью зависит от функции КесА клетки-хозяина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
