Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Колонку заполняют сорбентом 5пре1со 5Р-!000, 100 — 200 меш (Воре!со 1пс., Ве!1е1оп1е, Ра.) или 5 "/о-ным РРАР на хромосорбе 6. И летучие жирные кислоты, и их метиловые эфиры анализируют на одной и той же колонке. Температура термостата колонок 135 — 145'С. В качестве газа-носителя используют гелий, скорость потока которого равна 120 сьР/мин. Если прибор снабжен отдельными нагревателями для доватора н детектора, их температуру устанавливают на 20 — 30'С выше температуры колонки. Используют самописец на 1 мВ со скоростью движения бумаги 1,3 см/мин.
Готовят стандарты для летучих кислот, спиртов и нелетучих кислот (разд. 20.4.18) и экстрагируют их так же, как пробы с культурой. Такие стандарты можно приобрести у любой торговой организации, поставляющей реактивы для хроматографии. О наличии нли отсутствии, а также о приблизительных количествах различных конечных продуктов метаболизма судят по профилю, который можно использовать для идентификации бактерий.
Дополнительные количественные данные можно получить методом абсолютной калибровки, используя стандартные калибровочные кривые для каждой кислоты или спирта. Порядок элюирования спиртов и летучих жирных кислот из газохроматографической колонки таков: этанол, и-пропапол, нзобутанол, н-бутанол, нзоамиловый спирт, н-пентанол, уксусная, муравьиная, пропионовая, изомасляная, н-масляная, изовалернановая, и-валериановая, нзокапроповая, к-капроновая и гептановая кислоты. 47 ЧАСТЬ У.
СИСТЕМАТИКА Метнловые эфиры нелетучих кислот элюируются в следующем порядке: эфир пировиноградной, молочной, щавелево-уксусной, щавелевой, метилмалоновой, мало- новой, фумаровой и янтарной кислот. Водород и метан Образование водорода и метана определяют в культурах, выращенных в среде, содержащей глюкозу или другие сбраживаемые углеводы.
Пробирки с культурамп закрывают резиновыми пробками и инкубируют. После того как культуры вырастут, из пространства над культуральной средой отбирают пробы газа, вводя иглу шприца через резиновые пробки, Для этого пользуются 1- или 5-мл пластмассовым шприцем одноразового пользования с иглой длиной 3,8 см. Иглу вводят между резиновой пробкой и стенкой пробирки, а если понадобится, и через пробку под углом, позволяющим ей войти в газовую фазу над культуральной средой. Отбирают 0,7 — 1,0 мл газовой фазы и вводят в газовый хроматограф.
Газовый хроматограф должен быть оснащен детектором по теплопроводности. В качестве газа-носителя используют азот или аргон со скоростью потока 25— 30 см'/мин. Колонку из алюминия нли нержавеюшей стали длиной 1,83 м и диаметром 0,64 см заполняют снликагелем (Х 12, 80 — 100 меш; Бпре!со 1пс., Ве11е(оп1е, Ра.). Температура термостата колонки 25 — 30'С; если прибор оснащен раздельными термостатами доза- тора и детектора, их устанавливают на ту же температуру, что н термастат колонки, или на несколько градусов выше. Стандарты для анализа газа продаются любой фирмой, поставляющей материалы для хроматографии.
Для определения точки элюировання метана используют природный газ. В случае смеси водорода и метана водород элюируется из колонки раньше, чем метан. 20.2.2. Оптическое вращение молочной кислоты (7, 24) К 1О мл культуры и 10 мл неинокулированной среды добавляют 0,2 мл 50%-ной (по объему) Нт50,. Ко1щентрацию молочной кислоты определяют (в мнллиэквива- аь овшАя хАРАктеРистикА лентах на 100 мл) методом газовой хроматографии и используют для этого 1 мл подкисленной культуры (равд. 20.2.1). Для определения оптического вращения по описанному ниже методу минимальная концентрация молочной кислоты должна быть 1 мэкв/100 мл.
Приготовление растворов хлорной кислоты, буфера, лактатдегидрогеназы и 5(АР описано в равд. 20.4.8. 1.-(+)-Молочную кислоту н рабочий стандарт готовят следующим образом. К 5,0 мл подкисленной неинокулнрованной среды добавляют 0,0296 г 1.-(+)-молочной кислоты (кальциевой соли) и 5,0 мл дистиллированной воды. 1,0 мл этого раствора добавляют к 1,0 мл хлорной кислоты. Центрифугируют н собирают надосадочную жидкость, которая является рабочим стандартом (1,0 мкмоль 1.-(+)-молочной кислоты в 0,1 мл). К 1,0 мл подкисленной культуры добавляют 1,0 мл дистиллированной воды н 2,0 мл хлорной кислоты.
Иентрнфугируют и отделяют надосадочную жидкость, которая служит образцом при определении оптического вращения. К 1,0 мл подкисленной неияокулированной среды добавляют 1,0 мл дистиллированной воды и 2,0 мл хлорной кислоты. Смесь центрифугнруют и отделяют надосадочную жидкость, которая является основным контрольным раствором. Берут 7 стеклянных пробирок 12Х75 мм. В пробирку 1 вносят 0,1 мл основного контрольного раствора. В пробирки 2 — 6 вносят соответственно 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 н 0,10 мл рабочего стандарта молочной кислоты. Добавляют в каждую пробирку соответственно 0,08; 0,06; 0,04; 0,02 и 0,00 мл основного контрольного раствора и доводят объем жидкости до 0,10 мл.
В пробирку 7 вносят 0,10 мл испытуемого образца. В каждую из семи пробирок добавляют последовательно по З,О мл буфера н О,ОЗ мл раствора лактатдегидрогеназы. Затем добавляют 0,1 мл раствора 5(АР, закрывают каждую пробирку парафнльмом н осторожно переворачивают несколько раз для перемсшпвания растворов (пробирки не встряхивать). Инкубнруют при ЗО'С в течение 60 мин, точно выдерживая время с момента добавления НАР в 1-ю пробирку. 49 часть тг.
систимлтикл В каждой пробирке измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 340 нм. Если на используемом приборе нельзя снимать показания при этой длине волны, измеряют при длине волны, близкой к 340 нм, например в случае спектрофотометра Ярес1гоп(с 20 (Вапзсй апг( 1.огпЬ, 1пс., г(осЬез1ег, (ч(. 'г'.) устанавливают длину волны 366 нм. Пробирку 1 используют в качестве контроля при установке прибора на нуль. Снимают показания величины оптической плотности, точно соблюдая ту же последовательность, в которой добавляли Ь(А(У.
Для снятия показаний пользуются одной и той же кюветой; после измерения содержимое кюветы выливают, кювету споласкивают и заполняют следуюгцнм раствором. На миллиметровой бумаге строят график зависимости оптической плотности от количества 1.-(+)-молочной кислоты (О,О; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 мкмоль соответственно в пробирках 1 — 6). Калибровочную кривую проводят с максимальной точностью. На основе этой стандартной кривой определяют количество (.-(+)-молочной кислоты в микромолях в пспытуемой пробе (пробирка 7).
Эту величину умножают на 4 и получают количество 1.-(+)-молочной кислоты в миллиэквивалентах на 100 мл культуры. Вычисляют процент 1-(+)- молочной кислоты по формуле: мзкв ь-(+]-молочвой кислоты (результат ферментатнвной реакции) 100. мысе молочной кислоты (абгцее содержание, определенное с помогнью газовой хроматографии) в 100 мл 20.2.3.
Системы комбинированного тестирования В продаже имеется несколько удобных систем для быстрой идентификации различных групп бактерий, особенно сем, Еп1егоЬас1ебасеае. Полную информацию по идентификации с помон(ью таких систем можно получить от фирм-изготовителей. Там же можно получить бланки для фиксирования результатов: таблицы, системы кодирования илн характеристичные профили, разработанные для этих систем. Ниже дано краткое описание некоторых систем, а также ссылки на литературу, 50 20.
Овщля хлРАкзегнстикх из которой можно составить представление об их точности и надежности. Система АР! 20Е для идентификации Еп1егоЬас1ег)асеае и несбраживающих бактерий (Апа1у1аЬ Ргобпс1з, Р1а!пч!ещ, Ь!У 11803) состоит из пластмассовой пластинки с 20 вставленными в нее микропробирками, содержащими (в сухом виде) различные среды, с помощью которых можно провести 23 биохимических теста в течение 18 — 24 ч. Среды становятся пригодными для использования при добавлении в микропробирки разбавленной суспензии испытуемых микроорганизмов.
Суспензию предохраняют от высыхания, добавляя воду в углубления в пластмассовой пластинке, в которую помещают пробирки. В некоторые микропробирки добавляют стерильное вазелиновое масло для предотврагцення доступа кислорода. Оценка надежности системы дается в работах [16, 31, 40, 68 — 70, 76, 78, 81!.
Система АР! 20А для анаэробов (Апа1у1аЬ Ргобцс1з) похожа па систему АР! 20Е. Колонии бактерий суспенднруют в среде для анаэробов и суспензию используют для разведения сухих сред в микропробирках в аэробных условиях. Затем пластинку с микропробирками помешают в анаэростат или аназробный бокс и ннкубируюз от 24 до 48 ч при 35 — 37'С !62). Система Еп1его-Яе1 20 для идентификации Еп1егоЬас1еПасеае (Г!зсЬег Зс!епИИс Со., !У!айпоз1!сз (У!ч., ОгапцеЬпгц, !4У 10962) похожа на систему АР1.
Их отличие состоит в том, что при заполнении микропробиро., первой сцстемы бактериальной суспензией из пих удаляется воздух. В некоторые пробирки добавляют масло, чтобы предотвратить доступ кислорода к среде. Система М(п!1е1г для Еп1егоЬас1ег)асеае, несбраживающих бактерий, Же!езег!а и анаэробов (ВВ1. М(сго- Ь!о!оку Зуз1егпз, Соскеузч!11е, Мб 21030) состоит из пластмассовой пластинки с 12 лунками. С помощьюспециального устройства в лунки помещают диски, импрегнироваппые субстратами. Набор дисков подбирают фирма-изготовитель илн те, кто ими пользуется. С помощью автоматической пипетки со стерильным наконечником одноразового пользования в каждую лунку номе~дают суспензию испытуемой бактерии в бульоне М!пйей. Некоторые лунки покрывают слоем масла.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
