Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 7
Текст из файла (страница 7)
метод 1) [79). В ином варианте добавляют раствор метилового зеленого (равд. 20.4.9) до ковечной концентрации 0,005% (851. На среде с толупдиновым синим делают посев тест-организма штрихом через всю чашку, а на среде с метиловым зеленым культуру сеют истощающимся штрихом для получения отдельных колоний. Положительная реакция: появление ярко-розовой зоны вокруг участка роста на чашках с толундиновым синим и бесцветной зоны на зеленом фоне чашка с метиловым зеленым. Эти методы дают более удобную. для наблюдения реакцию иа ДНКазу, чем метод 1 Примечание: методы с использованием указанных красителей не следует применять для бактерий, выращи- ЧАСТЬ Ъ'.
СИСТЕМАТИКА ваемых в анаэробных условиях, поскольку индикаторная система может не сработать [751. Метод 3 [32). Этот метод применяют в качестве более быстрого теста на ДНКазу, однако он не позволяет обнаруживать очень низкую ДНКазную активность [321. Готовят диагностическую среду, содержащую 31,5 мг ДНК (ОИсо 1.аЬога!оНез), 5,0 мл 0,1 М СаС!г и 5,0 мл 0,1 М МпС!1 в 100 АТл трис-буфера, рН 7,4. Делают густую (молочного пвета) суспензию культуры в 0,5 мл этой среды и ннкубируют 2 ч при 37'С.
К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1,6 мл раствора метилового зеленого (разд. 20.4.9), а затем смешивают 2 капли этого раствора с суспензией бактерий. После перемешивания смесь инкубируют еще 2 ч прн 37'С. Положительная реакция: отсутствие окраски. Отрицательная реакция: сине-зеленая окраска. 20.1.42. 07129 На поверхность инокулированного агара в чашке Петри помещают 1 — 2 кристалла 2,4-диамино-6,7-днизопропилптеридинфосфата (5!дгпа СЬегп!са! Со., Я. 1.он(з, Мо.). В другом варианте стерильные бумажные диски (диаметром 6 — 8 мм) импрегнируют раствором этого реактива (0,1 г в 100 мл ацетона), высушивают и помещают в чашки с инокулированной агаровой сре,дой.
Положительная реакция: вокруг кристаллов или дисков видна зона подавления роста. Примеры: положительный результат — к!Ьг(о рагайаето1у1киз; отрицательный — Езсйепс1иа соД. 20.1.43. Оптохин Стерильный имеющийся в продаже (РИсо ЬаЬога!от!ез, ВВ1. М!СгоЬ!о!оду Зуз(ешз) оптохиновый диск для дифференциации микроорганизмов или стерильный бумажный диск, импрегнированный 0,02 мл 0,025%-ного раствора оптохина (гидрохлорида этилгидрокупреина; В!пша СЬеш!са1 Со., Я, 1.ошз, Мо.), помещают на поверхность инокулнрованной агаровой среды в чашке Петри. Положительная реакция: вокруг диска видна зона подавления роста. 20.
ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Примеры: положительный результат — о1гер1ососсиз рпеитоп)ае; отрицательный — другие альфа-гемолнтические стрептококки. 20.1.44. Орнитиндекарбоксилаза См. метод 1 с использованием аргиннндезиминазы (разд. 20.1.5). Вместо аргипина используют 1%-ный раствор дигидрохлорида ).-орнитина (или 2%-ный раствор Р1.-формы). Примеры; положительный результат — ЕИ1егооас1ег аегодепез; отрицательный — Рго1еиз ои!йапз. 20.1.45. Оксидаза Метод 1. На отрезок фнльтровальной бумаги наносят несколько капель 1%-цого раствора дигпдрохлорида тетраметил-о-феннлендиамина (515та С11еш)са1 Со., 51.
1.оц)з, Мо.), приготовленного в тот же день. Выросшую культуру снимают с поверхности агаровой среды платиновой петлей (обычпые петли из нихромовой проволоки могут давать ложноположнтельную реакцию) и наносят ее на увлажненную бумагу.
Положительная реакция: развитие фиолетовой или пурпурной окраски в течение 10 с. Примеры: положительный результат — Рзеиг1отоааз аегий(поза; отрицательный — ЕзсйепсЫа со15 Метод 2. Этот метод менее чувствителен, чем метод 1, ио он более удобен. Несколько капель смеси (1: 1, по объему) 1 %-ного а-нафтола, растворенного в 95%-ном этаноле, н свежеприготовленного 1 %-ного водного раствора оксалата диметил-п-фенилендиамина (РЫсо 1.айога1оиез) наносят на колонии в чашках с агаром. В другом варианте к жидкой культуре добавляют 0,2 мл я-нафтола и 0,3 мл диметил-п-фенилендиамина и энергично перемешивают. Положительная реакция: окрашивапие колоний нли бульонной культуры в фиолетово-синий цвет в течение 10 — 30 с.
20.1.46. О/Р-тест Готовят основной раствор исследуемого углевода (обычно глюкозы), стерилизуют его путем фильтрования и добавляют с соблюдением правил асептики при 45— ЧАСТЬ Ч. СИСТЕМАТИКА 50'С в автоклавированную полужидкую основную среду до конечной концентрации 0,5 — 1%. Чаще всего используют основную среду Хью и Лейфсоиа 1441 (равд. 20.3,17). Если микроорганизмы не способны расти на этой среде из-за недостатка необходимых питательных веществ, добавляют дрожжевой экстракт (0,17») или сыворотку крови (2%). Когда кислотообразование маскируется веществами щелочной природы, образующимися из пептона, можно использовать среду Борда и Холдинга 1201 (разд. 20.3.8). Если рост тестируемого микроорганизма ннгнбируется содержащимся в среде бромтнмоловым синим, следует заменить его такими индикаторами, как феноловый красный или бромкрезоловый пурпурный.
Для морских бактерий целесообразно использовать модифицированную для теста О/Г (МОР) среду Лейфсона «551 (равд. 20.3.19). Для осуществления теста пробирки с полужидкой средой, содержащей углеводы, помещают на несколько минут в кипящую водяную баню для удаления большсй части растворенного кислорода; затем их быстро охлаждают и столбики среды инокулируют с помощью прямой иглы. После инокуляции среду в одной из пробирок покрывают 10-мм слоем стерильного растопленного петролатума (это так называемая «анаэробная» пробирка).
Среду во второй пробирке ничем не покрывают («аэробная» пробирка). Для выявления неспсцифических реакций готовят контрольные пробы: 1) нпокулируют такую же среду, не содержащую углевода 2) инкубируют стерильную среду с углеводом. Результаты интерпретируют следующим образом. 1) Если кислота образуется только в аэробной пробирке, клетки катаболизируют углевод с использованием О» (реакция «0»). В этой пробирке рост должен быть заметным. 2) Если подкисление происходит ив аэробной, и в анаэробной пробирках, клетки способны также к брожению (реакция «Р»).
Рост должен быть заметен в обеих пробирках. 3) Если кислота не образуется ни в одной из пробирок, клетки не способны катаболизировать углевод. Если рост отсутствует, возможно, что в среде нет какого-либо питате|льного вещества, необходимого для роста изучаемого микроорганизма. Примеры: реакция «Е» с глюкозой — 51арйу1ососсиз ЗО. ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ерЫегтЫ(з; реакция «О» с глюкозой — М1стососсиз иаг1апз; отрицательный результат с глюкозой — Рзеие(отопаз 1ешо1апей 20.1.47. Фенилаланнндезаминаза Густо засевают скошенный агар с фенилаланином (разд. 20.3.26).
После инкубацин наносят сверху на косяк 4 — 5 капель 10%-ного раствора хлорида железа(П1). Положитсльная реакция; появление зеленой окраски, свидетельству|ощей об образовании фенилпирувата. Примеры: положительный результат — Рго1еиз ии1- паг(з; отрицательный — Езс(1епсМа со(0 20.1.48. Фосфатаза Метод 1. Этот метод используют для определения присутствия как кислой, так и щелочной фосфатазы. В агаровую ростовую среду, например питательный агар (разд. 20.3.25), расплавленный и охлажденный до 45— 50'С, добавляют с соблюдением правил асептики достаточное количество 1Б/о-ного раствора натриевой соли дифосфата фенолфталеина (Япша Селеш(са1 Со., Я. 1.он1Б, Мо.), стерилизованного фильтрованием, до конечной концентрации 0,017».
Чашки с инокулированным штрихом агаром инкубируют от 2 до 5 дней. На крышку перевернутой чашки наносят 1 каплю раствора нашатырного спирта (удельный вес 0,880, концентрация 28 — ЗОБ7з) и вставляют в них перевернутые чашки с культурой, для того чтобы пары аммиака достигли колоний, Положительная реакция: в результате образования свободного фенолфталеина колонии становятся красными. Примеры: положительный результат — 51арйу1ососсиз аигеиз; отрицательный — М1сгососсиз иагсапз. Метод 2 122).
Этот метод применяют для обнаружения только кислой фосфатазы. Готовят очень густую суспензию клеток в физиологическом растворе (0,857о МаС1). 0,3 мл суспензии добавляют к 0,3 мл раствора субстрата, содержащего 0,1 М цитратный буфер, рН 4,8, и 0,01 М динатрнй-и-нитрофенилфосфат (Яапа Сйегп(са1 Со.). Смесь ннкубируют 6 ч при 37'С. Затем 39 ЧАСТЬ Т. СИСТЕМАТИКА добавляют 0,3 мл 0,04 М глицинового буфера, рН которого доводят до 10,5 с помощью 1)аОН.
Ставят также контрольные пробы без бактерий. Положительная реакция: появление желтой окраски, свидетельствующей об активности кислой фосфатазы. Метод 3. Этот метод применяют для обнаружения только щелочной фосфатазы. Он совпадает с методом 2 с той лишь разницей, что и-нитрофеннлфосфат растворяют не в цитратном, а в глициновом буфере. Для развития желтой окраски добавления глииинового буфера пе требуется. 20.1.49. Присутствие поли+гндроксибутирата [53, 901 Выращивают бульонную культуру микроорганизмов в условиях, способствующих образованию поли р-гндроксибутирата (ПГБ).
Для аэробных бактерий такими условиями являются лимитирование экспоненциального роста по азоту при избытке источников углерода и энергии, а также лимитирование по кислороду. Предварительные доказательства присутствия ПГБ (равд. 3.3.11) можно получить в реакциях окрашивания, однако для точного определения требуется химическни анализ. Химический анализ, 1 мл культуры вносят в коническую стеклянную центрнфужную пробирку, добавляют к нему 9 мл щелочного гипохлорнта (равд. 20.419) и инкубируют 24 ч при комнатной температуре [90). В другом варианте к 2 мл культуры добавляют 8 мл 5э/э-ного гипохлорита (имеющейся в продаже хлорной извести) и инкубируют [721. Гипохлорит расщепляет большинство клеточных компонентов, но не расщепляет гранулы ПГБ.
Смесь центрифугируют для сбора гранул, а прозрачную надосадачную жидкость удаляют. Осадок промывают, суспендируя его в 10 мл дистиллированной воды, центрифугируют и надосадочную жидкость удаляют. Еще раз промывают водой, затем дважды 1О мл ацетона и, наконец, дважды 10 мл днэтнлового эфира Осадок высушивают и добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 10 мип. Охлаждают ее содержимое до комнатной температуры и с помощью УФ-спектрофо- 40 РХ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА томстра в кварцевых кюветах снимают спектр оптической плотности пробы по точкам от 215 до 255 нм через каждые 5 нм.
В контрольную кювету вносят концентрированную серную кислоту. (Если оптическая плотность прн 235 нм превышает 1,0, то пробу следует развести серной кислотой в соотношении 1: 1О или выше.) Положительная реакция: наличие пика оптической плотности прн 235 нм благодаря присутствию кротоповой кислоты, образующейся пз ПГБ под действием серной кнс лоты. Примеры: положительный результат — Ряеиг(отопая 1етощпе1; отрицательный — Ряеипоп2опая аегип(. паяа. 20.1.50.
Гидролиз поли-8-гидроксибутирата 188) Способность к гндролизу ПГБ является важным свойством с точки зрения дифференциации бактерий рода Ряеиг)отопая; однако необходимой для анализа суспензии гранул ПГБ нет в продаже и приготовить ее довольно сложно. Подробности приготовления этой суспензии описаны в равд. 20.4.15. Готовят агар без источника углерода, как описано в разд. 20.2.5, и разливают его в чашки. Ко второй порции среды, расплавленной и охлажденной до 45 — 50'С, добавляют достаточное количество стерильной концентрированной суспензни гранул ПГБ до конечной концентрации в среде 0,25% (вес/объем). Лгаризованную суспензию гранул наливают в чашки с затвердевшей средой для образования тонкого поверхностного слоя.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
