Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Если среда не затвердевает, то это свидетельствует о гидролизе жела- тины; если же она затвердевает, то ее переносят вместе с контрольной пробой в помещение с комнатной температурой или в термостат с температурой 30'С н инкубнруют в наклонном положении около 30 мнн. Когда среда в опытной пробе разжижается раньше, чем в контрольной, этот результат расценивается как слабая положительная реакция. (В) Так же, как в методе Б, но с 4»» желатины. .Этот метод более чувствителен, чем метод Б. Метод 2. Этот метод более чувствителен, чем методы 1А или !Б. Агаровую среду в чашках, содержащую 0,4з желатины, инокулируют штрихом.
Инкубируют при оптимальной для роста данного организма температуре. Заливают чашки реактивом, осаждающим жела- тину [15% НдС!з в 20$-ной (по объему) конц. НСЦ. Положительная реакция: зоны просветления вокруг колоний. Метод 3. Это чувствительный метод, дающий возможность быстро получить результат. Бактерии выращивают в пробирке с бульоном, содержашим диски с активированным углем и желатиной (равд.
20.4.3). Положительная реакция: освободившиеся частицы активированного угля могут распределяться по всему объему среды. 20.1.25. Окраска по Граму Методика окраски по Граму описана в разд. 3.3.5. 20.1.26. Гемолиз Метод 1. Кровяной агар в чашке засевают штрихом (равд. 20.3.7).
Инкубируют при 37'С 24 — 48 ч. В результате р-гемолиза вокруг колоний образуются проз- 24 ВК ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА рачные бесцветные зоны. Эритроциты в этих зонах полностью лизируются. В результате а-гемолиза образуется нечеткая зона частнчно разрушенных эритроцитов, часто с появлением зеленовато-коричневой окраски среды. В результате а'-гемолиза непосредственно вокруг колоний образуется небольшой ореол из целых или частично лизированных эритроцитов, а к нему примыкает зона полного гемолиза, распространяющаяся далее в среду.
При визуальном просмотре а'-гемолиз можно спутать с (1-гемолизом. Примечание: некоторые бактерии, например определенные стафилококки, осуществляют р-гемолиз только в том случае, если чашки с инокулированпой средой предварительно инкубируют 48 ч при 37'С, а затем охлаждают в холодильнике в течение 1 ч (горяче-холодный гемолиз). Метод 2, Чашку с основой кровяного агара (без добавления крови) инокулируют штрихом. Засеянную среду заливают 10 мл кровяного агара (при 45 — 50'С).
В данном случае а- или (1-гемолиз может быть более четко выражен, чем в методе 1, поскольку колонии погружены в агар и это обеспечивает некоторую защиту гемолитических ферментов (гемолизинов), способных инактивироваться под действием кислорода. 20.1.27. Гидролиз гиппурата Метод 1. Готовят бульонную среду с добавлением 1,00(0 гиппурата натрия, Попле автоклавирования отмечают уровень среды в каждой пробирке. Среду инокулируют и инкубируют 4 дня параллельно со стерильной контрольной пробой. Если среда частично испаряется, в конце инкубационного периода добавляют дистиллированную воду до первоначального уровня.
В небольшую пробирку вносят 1,0 мл стерильного контрольного бульона и добавляют порциями по 0,10 мл раствор хлорида железа(111) (12 г ВЕС!0 6Н00 в 100 мл 2!0-ной НС!). После каждой добавки пробирку встряхивают. Сначала выпадает осадок гиппурата железа, который после дальнейших добавок хлорида железа(111) растворяется с образованием прозрачного раствора. Определяют наименьшее обшее количество хлорида железа(П1), которое приводит к растворению осадка.
Иссле- 25 ЧАСТЬ У. СИСТЕМАТИКА дуемую бульонную культуру центрифугируют, переливают 1,0 мл надосадочной жидкости в другую пробирку и добавляют к нему раствор хлорида железа(ГП) в объеме, эквивалентном количеству, определенному ранее для контроля. Положительная реакция: образование плотного устойчивого осадка бензоата железа. Примеры: положительный результат — отгертососсиз айа!асйае; отрицательный — Ягер1ососсиз руоттепез, Метод 2 (46). Этот метод позволяет более быстро проводить определение гидролиза гиппурата. Готовят 1 Ъ-пый раствор гиппурата натрия в дистиллированной воде н разливают в пробирки по 0,4 мл.
Пробирки, закрытые пробками, хранят в морозильнике при — 20'С. Перед экспериментом содержимое пробирок размораживают и смешивают с ним до получения очень густой суспензии полную петлю выросшей культуры, взятой с поверхности твердой среды. Пробирку инкубируют в блочном термостате или в водяной бане при 37'С в течение 2 ч. После ннкубации добавляют приблизительно 0,2 мл нингидринового реактива 13,5 г нингидрина растворяют в 100 мл смеси ацетона и бутанола (1: 1, по объему)1.
Пробирку не встряхивают (351. Инкубацию продолжают при 37'С в течение 10 мин. Положительная реакция: появление темно-фиолетовой окраски за счет глицина, образующегося при гидролизе гиппурата. Отрицательная реакция: отсутствие окраски или наличие лишь слабого фиолетового оттенка. Следует использовать контрольные пробы с микроорганизмами, для которых реакция уже известна. 20.1.28. Образование сероводорода Метод 1, Используют длинную пробирку с агаровой средой, содержащей 0,025А) цитрата железа(1П)-аммония или 0,015с)а сульфата железа(11).
Среда должна содержать источник органической серы (обычно пептон), а также тиосульфат натрия (от 0,008 до 0,03%), так как некоторые бактерии могут образовывать НЕ3 лишь из одного из этих источников серы, Образование сульфида обычно лучше всего происходит в анаэробных илп полуанаэробных условиях, поэтому ннокулируют столбики агара. Положительная реакция: почернение 26 20, ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА среды во время роста за счет образования сульфида железа (разд. 20.1.54).
Примеры: положительный результат — Рго1еиз пи1- паг(г; отрицательный — ЕзспегГС)па со(1. Метод 2. Этот метод более чувствителен, чем метод 1. Фильтровальную бумагу разрезают на полоски 5Х20 мм и погружают в раствор 5~/а-ного ацетата свинца. Полоски стерилизуют в пробирках, закрытых ватными тампонами, и сушат в сушильном шкафу. Инокулнруют пробирку с жидкой средой, содержащей источники серы (см. метод 1).
Перед инкубацией в пробирку помещают бумажную полоску так, чтобы ее конец находился приблизительно на 1,3 см выше уровня среды; верхнюю часть полоски можно закрепить ватной или какой-либо другой пробкой. Полоска не должна соприкасаться со средой. Точно так же готовят и неинокулированные контрольные пробирки. Положительная реакция: почернение нижней части полоски после нескольких дней инкубации.
20.1.29. Образование индола Метод 1. Инокулируют безуглеводную и безнитритную жидкую среду, содержащую источник триптофана (например, 1$-ный трнптоновый бульон или среду с 0,1%1.-триптофана). Испытывают культуры различного возраста следующим способом: добавляют 1 мл кснлола (нли толуола, насыщенного водой), культуру сильно встряхивают для экстрагирования индола н затем оставляют до образования на поверхности слоя ксилола. Держа пробирку наклонно, вливают 0,5 мл реактива Эрлиха (равд.20.4.5) тонкой струйкой по стенке пробирки до образования слоя между ксилолом и бульоном. Пробы оставляют стоять 5 мин. Положительная реакция: образование красного кольца под слоем ксилола.
Проверяют так же контрольную пробу с неинокулированной средой, Примечание: если ростовая среда содержит углевод, синтез триптофаназы — фермента, ответственного за образование индола, — может подавляться 1211. Кроме того, обнаружению индола может препятствовать нптрит в концентрации 0,75 мг1ыл нлн выше [87); по- 27 ЧАСТЬ У, СИСТЕМАТИКА этому присутствие нитрата в среде может приводить к ложноположительному результату, если организм способен восстанавливать нитрат до нитрита.
Примеры: положительный результат — Езспепс)иа соИ; отрицательный — Еп(егоеас(ег аегодепез. Метод 2. Этот метод менее чувствителен, чем метод 1, однако он не требует применения воспламеняющихся и токсичных растворителей, При его применении экстракцию ксилолом не проводят и используют реактив Ковача (равд. 20.4.7), а не Эрлиха.
0,5 мл реактива добавляют в бульонную культуру и пробирку осторожно встряхивают, Положительная реакция: появление красной окраски. Метод 3. Фильтровальную бумагу разрезают на полоски и опускают в слегка подогретый насыщенный раствор щавелевой кислоты. При охлаждении на полосках образуются кристаллы кислоты. Полоски тщательно высушивают (стерилизация нагреванием необязательна) и перед инкубацией помещают нх с соблюдением правил асептики в пробирку с культурой. Полоски не должны соприкасаться со средой, их следует изогнуть так, чтобы они были прижаты к стенке пробирки н оставались около ее отверстия при закрывании ватной пробкой или завинчивающейся крышкой.
Положительная реакция: окрашивание в процессе роста культуры бумажной полоски в розовый или красный цвет. 20.1.30. Образование 2-кетоглюконата при окислении глюкозы Культуру выращивают в бульоне Хейнса (разд. 20.3.15), содержащем 47(е глюконата калия (стерилизованного фильтрованием и внесенного с соблюдением правил асептики). В процессе инкубации через различные периоды времени отбирают пробы по 1 мл н добавляют к ним 1 мл реактива Бенедикта (равд. 20.4.1). Смесь нагревают в бане с кипящей водой в течение 10 мин и быстро охлаждают.
Положительная реакция: образование желто-коричневого осадка оксида меди. Примеры: положительный результат — Рзеийотопаз пегий(поза; отрицательный — Езспег(сй(а со(й 28 ах ОБшАя хАРАктеРистикА 20.1.31. Образование 3-кетолактозы при окислении лактозы 119] Культуру выращивают на скошенной среде, содержащей 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы, 2% СаСОБ и 1,5 — 2,0Б/~ агара. Выросшую культуру снимают петлей с косяка и помещают в виде небольшой капли диаметром около 5 мм на поверхность лактозного агара в чашке Петри (1% лактозы, 0,1% дрожжевого экстракта, 2% агара). На одной чашке можно проверить от 4 до 6 различных штаммов.
После 1 — 2 дней инкубации поверхность агара заливают тонким слоем реактива Бенедикта (разд. 20.4.1). Положительная реакция: образование желтого кольца оксида меди(1) вокруг зоны роста, достигающего максимальной величины через 2 ч (приблизительно 2 — 3 см). Примеры: положительный результат — Адгойас(егшгп !игле/ас/епз и А. гаг((опас!ег; все остальные бактерии, изученные к настоящему времени, дают отрицательную реакцию. 20.1.32. Лецитиназа Желточный агар (разд.
20.3.14) в чашке засевают штрихом для получения изолированных колоний. Положительный результат: образование мутной (непрозрачной) зоны вокруг колоний. См. также «Липаза» (разд. 20.1.33). Примеры: положительный результат — С1оз!г1п1игп Рег/г1щепз; отрицательный — С(озгпйигп Ьи1уггсигп. 20.1.33. Липаза Метод 1 (7]. Желточный агар (равд. 20.3.14) в чашке Петри засевают штрихом. После инкубации снимают крышку чашки и внимательно просматривают поверхность при косом освещении. Положительный результат: образование маслянистого блестящего с переливами нли перламутрового слоя над колонией и вокруг нее на поверхности агара.
Примеры: положительный результат — С(озтгЫшт зрогодепез; отрицательный — С(оз/пЮигп ои!уг1сигп. 29 ЧАСТЬ У, СИСТЕМАТИКА Метод 2. Этот метод применяют для эфиров пальмнтиновой, стеариновой и олеиновой кислот [831. Используют агаровую среду с добавлением 0,01% СаС!т НтО. Стерилизуют твин 40 (эфир пальмитиновой кислоты), твин 60 (эфир стеариновой кислоты) или твин 80 (эфир олеиновой кислоты) автоклавированием прн 121 'С в течение 20 мин, Добавляют стерильный твин в расплавленную агаровую среду при 45 — 50'С до конечной концентрации !о)о (по объему).
Среду встряхивают до полного растворения твина, разливают по чашкам Петри, оставляют до затвердения и засевают штрихом. Положительный результат; появление мутного ореола вокруг колоний. При исследовании под микроскопом видно, что ореолы состоят из кристаллов кальциевого мыла. Примеры: положительный результат (твин 80)— Рзеийотопаз аегидтоза; отрицательный — Рзеийогпоиаз ригЫа. Метод 3. Этот метод г1рименяют для жиров различных типов 1121. Готовят жир нужного типа, окрашенный нильским голубым сернокнслым (разд.
20.4.11). Добавляют 1 мл эмульсии растопленного жира к 20 мл агара, расплавленного и охлажденного до 45 — 50'С. Хорошо перемешивают, разливают по чашкам Петри и после затвердения агара делают посев штрихом. Положительная реакция: образование синего ореола вокруг колоний. 20.1.34. Лизиидекарбоксилаза См. метод 1 для определения аргининдезиминазы (равд.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
