Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Вре- 51 ЧАСТЬ Н. СИСТЕМАТИКА мя инкубации для представителей сем. Еп(егоЬас1еласеае составляет от 18 до 24 ч, для несбраживающих бактерий — от 24 до 48 ч и для Хе/ззег а — 4 ч, Испарение в процессе инкубации предотвращают с помощью пластмассового увлажнителя.
В случае анаэробных организмов суспензию клеток в бульоне для анаэробов разливают в лунки с дисками и иньубнруют в анаэростате или анаэробном боксе в течение 48 ч !!7, 40, 41, 49, 89]. Система Ра(ЬоТес КарЫ 1-0 для идентификации Еп1егоЬас1ег1асеае и других групп (Степега1 Р!аппоз(!Сз П!и., %агпег-1агпЬег1 Со., Могг!з Р!а!пз, Ы3 07950) состоит из 10 полосок, пропитанных реактивами для тестов на фенилаланиндезаминазу, лизиндекарбоксилазу, утилизацию малоната н т. д. Полоски помещают в пробирки с суспензией испытуемых микроорганизмов; в некоторых случаях ими проводят по колониям клеток. Результат определяют приблизительно через 4 ч, за исключением теста на оксидазу, когда результат получают через 30 с (40, 68, 69].
Система Еп1его1пЬе для идентификации представителей сем. Еп1егоЬас1ег1асеа (КосЬе О!аюпов(!Сз, Ь)п!!еу, Ы 07110) состоит из пробирки с 8 отсеками, заполненными различными агаровыми средами. Через отсеки проходит канал с тонким металлическим стержнем. Выступающим концом стержня касаются колонии и затем протягивают его через все отсеки, засевая таким образом различные среды. Некоторые среды для защиты от воздуха покрывают слоем воска. Результаты учитывают после инкубации в течение 24 ч 139, 63, 68, 69, 92].
Система Ох!/Гегпт для идентификации несбраживающих грамотрицательных палочек (КосЬе П!аюпов!!Сз) похожа на систему Еп1его1пЬе, но предназначена для несбраживаюших организмов (31, 48, 71, 80]. Система Согп!пд г/Ь Еп1ег!с Р!11егеп1!а! для идентификации представителей сем. Еп1егоЬас1ег!асеае (Соти!пд Меб!Са! М!СгоЬ!о!оду Ргодис1з, Коз1уп, 14'т' 11576) состоит из двух пробирок обычного размера с сужениями посередине, разделяющими их на 2 отсека.
В пробирках находятся агаровые среды. Система позволяет определять 9 различных свойств, две дополнительные пробирки со средами позволяют осуществлять при не- 20. Овшля хлглктвгистика обходимости еще 6 тестов. В агар вводят до дна иглу с бактериями (через сужение), а затем вынимают ее и инокулируют штрихом скошенную поверхность агара. Результаты определяют через 18 — 24 ч [59, 78, 86[.
Система Согп!пн Ь!/Г для идентификации окисляюгдих грамотрицательных бактерий (Согп!пд Меб!са1 М!сгоЫо!оцу Ргоднс(з), состоящая из двух пробирок со средами (пробирки Сг[чР и 42Р), позволяет проводить первую оценку по результатам 5 реакций через 18 — 24 ч. Последующие тесты осуществляют в круглых пластмассовых чашках (чашки Ип(-.К/Р-Те)г) с углублениями, заполненными различными агаровыми средами. В них можно провести 12 дополнительных реакций, результаты которых регистрируют через 24 — 48 ч.
Среды в лунках инокулируют каплей бактериальной суспензии. Система М!его-1Р для идентификации бактерий сем. Еп1егоЬас1ег(асеае (Сгепега! В!аюпов!1св Р!ч., %агпег).ашЬег! Со.) представляет собой пластинку с 15 тест- камерами, содержащими диски фильтровальной бумаги, пропитанной реактивами и субстратами. Содержимое камер инокулируют суспензией бактерий. Нанесение сверху слоя масла для защиты от кислорода не требуется. Результаты учитывают после ннкубации при 37'С в течение 4 ч [16). 20.2.4. Многоточечные инокуляторы Широкое распространение имеющихся в продаже стерильных пластмассовых чашек для микротитрования (пластмассовых чашек с 96 миниатюрными лунками, каждая объемом около 0,2 мл) привело к развитию микрометодов, позволяющих определять образование. кислот из углеводов, образование газов и другие биохимические реакции.
Многоточечный инокулятор можно изготовить самостоятельно, вставив острыми концами булавки из нержавеющей стали с 27-мм головками в заполненные. воском лунки или чашку для микротитрования [36[. Можно также вколоть булавки или штифты в деревянную, пластмассовую или металлическую основу в точном соответствии с лунками в чашке для микротитровання [3?[. Металлический инокулятор обладает темя часть ч. систвматикА преимуществом, что его можно автоклавнровать, однако другие инокуляторы можно с успехом «стерилизовать», опуская булавочные головки в спирт и затем выдерживая их 1 — 2 с в пламени головками вверх [36].
Чтобы «зарядить» инокулятор, его приводят в контакт с клетками, опуская на шаблонную пластинку для микротитрования, каждая лунка которой содержит отдельный штамм бактерий; при этом на каждой булавочной головке остается около 0,006 мл культуры. Затем инокулятор приводят в контакт с пластинкой для микротитрования, лунки которой заполнены бульоном с углеводом. При этом каждая лунка с бульоном инокулируется определенным штаммом бактерий, находящимся на отдельной булавочной головке. Инокулятор вновь опускают на шаблонную пластинку для «перезаряжения» и инокулируют вторую пластинку для микротитрования, лунки которой заполнены средами с другим углеводом и т.
д. Для определения образования газа из углеводов каждую инокулированную лунку покрывают стерильной смесью, содержащей 1 часть амоджела (Ашег!сап О!1 Со.) н 1 часть вазелинового масла [38]. Инокулированные чашки закрывают крышками и инкубируют. Образование кислоты определяют по изменению цвета рН-индикатора, помещенного в среду. Накопление пузырьков под верхним слоем масла свидетельствует о газообразовании.
Заполнение лунок чашки для микротитрования стерильной средой можно значительно облегчить, пользуясь многоканальной автоматической пипеткой (Сооке Еп- 8!пеег!пп Со., Л!ехапдг!а, Уа.) или другим подобным устройством, Можно самостоятельно изготовить приспособление, описанное, например, Уилкинсом и др. [96]. Для этого берут иглы № 18 для подкожных инъекций, снимают с них наконечники и вынимают мандрены. Затем иглы припаивают медно-цинковым припоем к отверстиям на трубке из нержавеющей стали длиной 13,5 см и диаметром 7 мм так, чтобы расстояния между иглами были равны расстояниям между лунками пластинки для микротитрования (рис.
20.2). Один конец трубки оставляют открытым, а к другому концу припанвают медно-цинковым припоем соединитель типа Люер-Лок, После стерилизации всего устройства этот 20. ОВЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА соединитель прикрепляют с соблюдением правил асептики к стерильному автоматическому пипеточному шприцу типа Корнуолл (Вес(оп, Иск!паап апг) Со., Кп((гег1огг(, !х!.,).), снабженному стерильным шлангом для заполнения (рис. 20.2).
Конец шланга погружают в колбу со стерильной средой и заполняют шприц, несколько раз оттягивая поргпень. Затем восьмиигольчатую гребенку, 6 Рис, 20.2. Устройство для одновременного заполнения восьми лунок пластинки для микротнтровзння. У вЂ” трубка из нержзвеюшей стали; 2 — иглы для подкожных инъекций № !8, припаянные к трубке; 3 — плзсгинкз для микротитроввиия с лунками; 4 — соединитель. типа Люер-Лок, припаянный к концу трубки; б — ззполггяюшзя трубка, присоединеннзя к шприцу типа Корнуолл; б — цилиндр и поршень шприца. Нажимая нв поршень, одновременно заполняют стерильной средой 8 лунок. приготовленную таким образом, устанавливают над рядом из восьми лунок на пластинке для микрогитровання н надавливают на поршень шприца, вливая одновременно по 0,2 мл среды в каждое углубление.
Таким жеспособом заполняют все остальные ряды лунок на пластинке. Устройство промывают стерильной водой (или кипятком, если в лунки вносят агаровую среду) и загем заполняют другой средой, которую предстоит внести в лунки. О помощью пластинок для микротитрования можно. проводить и другие биохимические тесты. Например, тест на индол проводят, добавляя 2 капли реактива Ковача в культуры, находящиеся в лунках, а для проведения реакции Фогес — Проскауера в культуру добавляют 1 петлю а-нафтола и затем ! петлю КОН (37). Однако некоторые тесты нельзя проводить с помощью пластинок для микротитрования.
Например, при определении уреазы аммиак, образуемый уреазоположительными микроорганизмами, может диффундировать в соседние лунки и давать ложноположительный результат. 55 ЧАСТЬ Ю СИСТЕМАТИКА Для засева поверхности диагностического агара в обычных чашках Петри можно применять многоточечные инокуляторы [36, 57). С помощью таких инокуляторов с заостренными штифтами или булавками можно в случае необходимости инокулировать бактерии прокалыванием агара [65].
Однако при посеве различных штаммов в одной чашке может происходить чрезмерное разрастание или взаимное перекрываняе колоний. Эта проблема исчезает при использовании чашек Петри, разделенных на отсеки (Рупоз Р1аз11сз (.16., 5цг51- Топ, Биггеу Епц[апб) [57[, миниатюрных формочек для получения кубиков льда [367 или пластинок для микротитрования [37, 96[.
На последних можно приготовить маленькие косячки, например косячки агаровой среды с тремя сахарами и железом, и инокулировать их с помощью прокалывающего инокулятора [37). При многоточечной инокуляции анаэробов в лунки пластинок для микротитрования разливают стерильные полужидкие среды и инкубируют их с закрытыми крышками в течение ночи при 37'С для выявления посторонних бактерий, а также для подсушивания [95). Пластинки помещают в анаэробный бокс с перчатками и оставляют на 2 дня для восстановления сред перед инокуляцией.
Пластинки инокулируют с помощью прокалываю- щего инокулятора внутри бокса с перчатками. Хотя каждая пластинка имеет 96 лунок, инокулируют только 48 из них (в шахматном порядке), а 48 оставляют неинокулированными в качестве контрольных лунок для обнаружения изменений рН небиологического характера или возможной миграции подвижных бактерий из одной лунки в другую. После инокуляции каждую пластинку .закрывают полоской стерильной нетоксичной пластмассовой ленты (Сооке Епц(пеег1пц Со.).
Сначала ленту кладут на резиновую подставку липкой стороной вверх, а затем прижимают к ней перевернутую пластинку. Для того чтобы каждая лунка была плотно закрыта, по пластинке проводят роликом. Для выхода газов во время роста над каждой лункой делают отверстие с помощью ленточного перфоратора. Пластинку инкубируют в течение 3 дней в анаэробном боксе. Кислотообразование определяют с помощью топкого рН-электрода (такого, например, как электрод 5-30070-10, Багдеп1-%е!с(т аь ОБЩАЯ ХАРАкТЕРИСтикА Со., 8кок(е, 1П.), который вводят в среду в каждую лунку. Можно не промывать электрод после каждой лунки, так как при каждом погружении остатки агара на кончике электрода перемещаются вверх [951.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
