Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 6
Текст из файла (страница 6)
20.1.5). Вместо аргннина добавляют 1 % дигндрохлорида (.-лизина (или 2% Р(.-формы лизина). Примеры: положительный результат — 5еггаг1а тагсеесепз; отрицательный — Рго1еиз ии(йаги. 20.1.35. Потребление малонат» Пробирку с малонатным бульоном (разд. 20.3.21) ннокулируют молодой жидкой культурой или культурой, снятой с агарового косяка. Инкубируют прн 37 'С в течение 48 ч. Положительная реакция: изменение зеленой окраски на густо-синюю.
20. ОБШАя хАРАктеРнстнкА Примеры: положительный результат — К!ебз!е!!а рпеитоп!ае! отрицательный — Езсйег(сп!а со!!. 20.1.36. Разложение мяса анаэробами 17) Инокулируют предварительно восстановленный бульон, содержащий рубленое мясо (разд. 20.3.10), и одновременно пропускают через пробирку очищенную от кислорода двуокись углерода.
Инкубация длится 21 день. Положительный результат: разрушение частиц мяса с образованием рыхлой порошкообразной массы на дне пробирки. Примеры: положительный результат — С!оз!г!г(!игп зрогойепез; отрицательный — С!оз!г!г(!ит би!рг!сиги, 20.1.37. Тест с метиловым красным Инокулируют пробирку с бульоном МКЧР (равд. 20.3.24). Инкубация при ЗО'С продолжается в течение 5 дней (в большинстве случаев достаточно 48-ч инкубации при 37'С).
Добавляют 5 †капель раствора метилового красного (растворяют 0,1 г метилового красного в 300 мл 95Б/Б-ного этанола и разбавляют дистиллированной водой до 500 мл). Положительная реакция: появление ярко-красной окраски, свидетельствующей о том, что рН раствора ( 4,2. Отрицательная реакция: желтая или оранжевая окраска. Слабая положительная реакция: красно-оранжевая окраска. Примеры: положительная реакция — Езслег!сл!а со- !1; отрицательная — Еп!егобастег аегойепез, 20.1.38.
Воздействие на молоко Метод 1. Инокулируют пробирку с лакмусовым молоком (равд. 20.3.20). Реакции культур могут быть следующими. Подкисление: появление розовой окраски. Подщелачивание: появление синей окраски. Восстановление лакмуса: молоко становится белым за счет обесцвечивания лакмуса; обычно это происходит в нижней части пробирки. Кислый творожистый осадок: твердый розовый сгусток, который растворяется в щелочи и не сжимается. Творожистый осадок сычужного ти- 3! ЧАСТЬ Ю СИСТЕМАТИКА па: мягкий нерастворимый в щелочи сгусток, при сжатии которого отделяется сероватая сыворотка. Пептони. зация (протеолиз): молоко становится полупрозрачным в результате гидролиза казеина, начинающегося чаще в верхней части столбика среды; кроме того, среда часто становится щелочной.
Метод 2 [7]. Этот метод применяюг для апаэробов. Инокулируют предварительно восстановленную молочную среду (разд. 20.3.22), одновременно пропуская через пробирку двуокись углерода, очищенную от кислорода. Инкубация продолжается 3 нед. Проверяют паличие творожистого осадка и(или) пептонизации. 20.1.39. Подвижность Готовят влажные препараты нз молодых бульонных культур (т.
е. находящихся в экспоненциальной фазе роста), выращенных при двух различных температурах (например, 37 и 20'С). В некоторых случаях па средах, содер'кащих глюкозу, подавляется образование жгутиков !151. Методы исследования с помощью светового микроскопа описаны в разд. 3.3.4. Влажные препараты изучают сразу после приготовления.
При исследовании анаэробов лучше всего рассматривать среднюю часть препарата, а при исследовании аэробов — области около воздушных пузырьков и у края препарата. Не все клетки должны быть подвижными. Для того чтобы штамм бактерий был признан подвижным, необходимо обнаружить хотя бы одну клетку, меняющую свое положение по отношению по меньшей мере к двум другим клеткам 112). Примечание: подвижность следует отличать от броуновского движения (беспорядочного «покачивания» клеток) и от пассивного движения за счет потоков, образующихся под покровным стеклом. Движения анаэробов можно также наблюдать в капиллярной трубке, если набрать в нее немного бульона и запаять сразу же оба конца капилляра в узком кислородном пламени (31.
Капилляр рассматривают с достаточно сильным объективом без иммерсии. Некоторые бактерии, например принадлежащие к порядкам МухоЬас!еНа!ез н Су1орЬапа!ез, не имеют жгутиков, но обладают «скользящей подвижностью» аь ОбщАя хАРАктеРистикА при контакте с твердой поверхностью. Методы обнаружения и наблюдения за «скользящей подвижностьюэ описаны в равд.
3.3.4. 20.1.40. Восстановление нитрата и денитрификация Приготовление реактивов описано в разд. 20.4.12. Там же можно найти сведения об их канцерогенных свойствах. Метод 1 [66). Данный метод используют при количественном определении нитритов. Для этого инокулируют подходящую жидкую среду, содержащую 0,1Б/Б К1чО, и 0,17Б/Б агара (последний добавляют для получения полужидкой консистенции и создания полуапаэробных условий). Инокулят смешивают со средой очень осторожно, равномерно распределяя его по пробирке.
Во время инкубации периодически просматривают культуры для обнаружения пузырьков, что является предварительным указанием на денитрификацию. Контрольные культуры, выращенные без нитрата, не должны выделять газ и давать положительную реакцию на нитрит' по методу, описанному ниже. Для определения способности микроорганизмов восстанавливать нитрат в нитрит берут по О,1 мл культур различного возраста и добавляют к пим по 2 мл диагностического реактива (разд, 20.4.12). Затем добавляют воду до конечного объема 4 мл н оставляют на 15 мин для развития окраски. Интенсивность окраски измеряют визуально по пятибалльной шкале нли с помощью спектрофотометрз при 540 нм. Накопление интрига с увеличением возраста культуры означает восстановление нитрата до нитрнта„ в то время как образование вначале нитрнта с последующим снижением его уровня означает способность к дальнейшему восстановлению нитрита.
Если краспав окраска не появляется, добавляют до 5 мг цинковой пыли на каждый миллилптр смеси. Если нитрат в среде не восстановился, то добавление цинка приведет к его химическому восстановлению, о чем свидетельствует появление ь1расной окраски. Отсутствие окраски означает, что организм восстановил весь нитрит и, по-види- зз ЧАСТЬ Ч. СИСТЕМАТИКА мому, произошла денитрификация. В этом случае положительную реакцию на нитрит можно получить при тестировании более молодой культуры. Примечаниьч цинковая пыль при длительном хранении может инактивироваться, поэтому следует периодически проверять ее способность восстанавливать нитрат в интриг на непнокулированной пробе.
Примеры: реакция денитрификации — Рзеис(отоиаз аегия1поза; восстановление нитрата в нитрит — Езсиег(сИа со(1; отрицательный результат — Василия зрйаен'- сиз. Метод 2. Этот метод используют для качественного определения нитрита. Бактерии выращиваюттак же, как в методе 1. Периодически проверяют наличие в культуре пузырьков газа, что является предварительным указанием на денитрификацию. К культурам различного возраста добавляют по 1 мл растворов А и Б (разд. 20.4.12). Розовая или красная окраска свидетельствует о присутствии нитрита. При отсутствии окраски наличие нитрата в культуре проверяют с помощью цинковой пыли, как описано в методе 1.
Если пе обнаруживается ни нитрит, ни нитрат, вероятно, произошла денитрификация. Контрольные опыты, описанные в методе 1, пригодны и для метода 2, Другим способом доказательства образования газа является выращивание микроорганизма в нитратном бульоне (без агара) с маленьким перевернутым поплавком. При этом можно визуально наблюдать за накоплением газа во время денитрификации. Метод 3 (66). Этот метод позволяет обнаругкнвать оксид азота, образующийся при денитрификации, и обеспечивает более надежное доказательство наличия денитрификации, чем метод 1 или 2.
Инокулируют пробирки или колбы с полужидкой нитратной средой. Закрывают сосуды пенициллиновыми пробками и шприпем через пробку вводят газообразный ацетилен, полученный, как описано в разд. 20.2.7, до конечной концентрации 1% (по объему). Ацетилен предотвращает дальнейшее восстановление оксида азота ХзО, образовавшегося в процессе денитрификации, до Хз (181. После того как культура вырастает, отбирают шприцем пробы газа и определяют присутствие ХзО методом газовой хро- Ю ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА матографии на колонке 274 смл'.4,8 мм с порапаком Я (80 — 100 меш) при 35'С, используя детектор по термо.- проводности, а в качестве газа-носителя гелий. 20.1.41.
Гидролиз нуклеиновых кислот Метод 1. Этот метод используют для обнаружения как дсзоксирибонуклсазы (ДНКазы), так н рибонуклеазы (РНКазы). ДНК и РНК (81цша С!1ет1са! Со., 5!. !.ошз, Мо,) растворяют в дистиллированной воде в концентрации, достаточной для получения 0,2%-ного содержания в агаровой среде.
ДНК легко растворяется в воде. Для растворения РНК в воду медленно добавляют 1 н. МаОН, следя за тем, чтобы рН не был выше 5,0. Раствор нуклсиновой кислоты добавляют в агаровую среду непосредственно перед автоклавированием (!2! 'С, 15 чин) и разливают среду в чашки после охлаждения до 50'С. Делают посев культуры штрихом на твердой среде. После нпкубации па поверхность агара наливают 1 н.
НС!. Положительная реакция: появление вокруг участка роста чистой зоны, свидетельствующее о наличии ДНКазной или РНКазной активности. Примеры: положительный результат (ДНКаза) Ееггайа тагсезсепз; отрицательный (ДНКаза) — Еп1егобас1ег аегойепез. Метод 2. Этот метод используют только для теста на ДНКазу, Перед автоклавированием добавляют 100 мг толуидинового синего О (А!1!ег( Селеш!са! Согр., Нечг Уогк, )Х). У.) на литр диагностической среды, содержащей ДНК (см.