Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Если известны особые физиологические свойства, присущие микроорганизму, то это облегчает его идентификацию (например, способность к азотфиксации, деградации целлюлозы, биолюминесценции, потребность в морской воде для роста, образование пигментов нли потребность в геме).
Желательно использовать упорядоченный подход к идентификации, основанный на здравом смысле и на применении только тех тестов, которые имеют отношение к делу. Следует избегать подхода, который можно сравнить с «тыканьем пальцем в небо», когда применяют все виды тестов в отчаянной надежде па то, что какой-нибудь из них окажется полезным. Чрезвычайно ценными могут оказаться оглавление 8-го издания «Определителя Берги» 121 и приведенные там основные ключи, так же как общее описание различных порядков, семейств и родов бактерий. После исчерпания первоначальных возможностей можно обратиться к подробным ключам и таблицам, приводимым в различных пособиях (многне из них перечислены в списке общей литературы 11 — 131 в разд.
20.5.1) по идентификации родов и видов. На последних этапах идентификации новый штамм сравнивают либо с типовым штаммом чАсть ч. снствмАтнкл предполагаемого вида, либо с другим известным штаммом, принадлежность которого к данному виду точно установлена. Часто (особеино в случаях с патогенными бактериями) проводят быструю предварительную идентификацию до рода или вида с помощью диагностических сывороток.
Однако такие тесты бывают не абсолютно специфичными, и обычно для подтверждения полученных с их помощью результатов требуется проведение дополнительных физиологических тестов. Например, агглютинация грамотрицательных кишечных палочек поливалентной сывороткой Ба1топе11а является предварительным свидетельством в пользу их принадлежности к роду 5айпоае((а, но это обязательно должно быть подтверждено рядом биохимических тестов. При проведении диагностических тестов организм, используемый для инокуляции, должен быть свежепересеянным, в хорошем физиологическом состоянии. Старые накопительные культуры, которые могут содержать в большом количестве мертвые или отмирающие клетки, не пригодны для этих целей. Инокулнрованную диагностическую среду инкубируют в условиях, оптимальных для жизнедеятельности организмов или для проявления изучаемого свойства (например, оптимальные температура, рН, состав газов и ионный состав).
Методы тестирования следует использовать не только в отношении испытуемого организма, но также и в отношении штаммов, для которых наличие или отсутствие проверяемого свойства уже известно. Такой подход обеспечивает проверку надежности реактивов и сред. В конце этой главы приведены ссылки на обгцую литературу (20.5.1), где даны схемы идентификации различных групп бактерий, дальнейшая информация по методологии и дополнительные методы характеризации. 20.1. РУТИННЫЕ ТЕСТЫ 20.1.1.
Окрашивание на кислотоустойчивость Методика этого окрашивания описана в разд. 3.3.6. Положительная реакция указывает на Мусобас1егшлэ или Л'осапйа. 40 20, ОБщАя хАРАктеРистикА 20.1.2. Образование кислот из углеводов Метод 1. При подготовке среды в нее вводят рН- индикатор. В табл.
20.1 перечислены наиболее часто используемые индикаторы с указанием их свойств. Метод 2. В случаях, когда индикатор токсичен для бактерий или разлагается в процессе их роста, его следует добавлять каплями (0,02 — 0,040/0-ного спиртового раствора) в культуру после окончания роста.
Метод 3. Если применение индикатора нежелательно в силу этих же причин, а также для обеспечения более высокой точности, рН культуры следует измерять по окончании роста с помощью рН-метра. Используют длинный тонкий рН-электрод, который можно вводить прямо в пробирку с культурой. К верхней части электрода прикрепляют плоскую резиновую прокладку с ббльшим диаметром, чем диаметр пробирки с культурой, так чтобы кончик электрода был застрахован от удара о дно пробирки. При определении рН нескольких культур патогенных бактерий между измерениями электрод погружают в стакан с дистиллированной водой.
Позже эту воду автоклавнруют. По окончании работы электрод промывают дезинфициру)ощим раствором (например, 370-ной перекисью водорода или 700!0-ным этиловым спиртом). В случае когда анаэробные бактерии культивируют в предварительно восстановленном пептонно-дрожжевом бульоне (разд. 20.3.28) с углеводами, двуокись углерода, которую пропускают через пробирку во время инокуляции для предотвращения попадания кислорода, обычно снижает рН среды до 6,2 — 6,4. Вследствие этого культуры, выращиваемые на углеводном пептоннодрожжевом бульоне, обычно считаются подкисленными, если их рН составляет 5,5 — 6,0 (слабая кислота) или оказывается ниже 5,5 (сильная кислота).
Для культур, выращенных на пептоино-дрожжевом бульоне, содержащем арабинозу„рибозу или ксилозу, рН 5,7 или ниже обычно означает подкисление, поскольку стерильная среда, через которую пропускали двуокись углерода, после 1 — 2 дней ннкубации имеет рН 5,9 171. В любом случае в качестве контроля следует определять рН ЧАСТЬ Ч. СИСТЕМАТИКА культур в пептонно-дрожжевом бульоне, не содержащем никаких углеводов, так как в некоторых случаях могут образовываться кислоты из пептонов. 20.1.3. Гидролиз эскулина Культуры выращивают в бульоне или на агаровой среде с добавлением 0,01% эскулина и 0,05% лнмоннокислого железа. Положительный тест: появление коричневато-черной окраски среды.
Примеры: положительный результат — 5/гер/ососсиз /асса//з; отрицательный— Ягер/ососсиз т12(з. 20.1.4. Образование аммиака из аргинина Инокулируют аргининовый бульон (см. равд. 20.3,2 и 20.3.3) и контрольный бульон без аргинина. После инкубации в течение 2 — 3 дней анализируют культуры в спот-тесте с реактивом Несслера (равд. 20.4.10). Положительная реакция: появление желтой или оранжевой окраски в отличие от контроля.
Примеры: положительный результат — Ягер1ососсиз /песа(/з; отрицательный— Югер/ососсиз за(/оаг(из. 20.1.5. Аргиннндезимииаза Метод 1. Этот метод широко применяется для дифференциации членов сем. Еп1егоЬас1ег)асеае. Инокулируют основной бульон Медлера (равд.
20.3.23) с добавлением 1% моногидрохлорида !.-аргинина (или 2% РЕ- формы), а также контрольный бульон без аргинина. После инокуляции бульон заливают 10-мм слоем стерильного минерального (вазелинового) масла. Проверяют пробу ежедневно в течение 4 дней. Положительная реакция: фиолетовая или красновато-фиолетовая окраска. При слабой реакции образуется голубовато-серая окраска. Примеры: положительный результат— Еп/егоЬас/ег с!оасае; отрицательный — Рго/сиз ои1йаг/з. Метод 2.
Этот метод пригоден для широкого круга факультативных аэробов, Инокулируют полужидкую среду Торили, содержащую аргинин (равд. 20.3.32), а также контрольную среду без аргннина. После посева 12 сь ОБщАя ХАРАктегистикх в столбик уколом среду герметично покрывают слоем стерильного растопленного петролатума и инкубируют. Положительная реакция: изменение окраски от желто- оранжевой до красной в течение 7 дней.
Метод 3 (88). Этот метод применим для аэробов и факультативно анаэробных бактерий. Готовят густую суспензию бактерий в 0,033 М фосфатном буфере, рН 6,8 (разд. 20.4.16). В течение нескольких минут пропускают через суспензию (4 мл) азот, а затем добавляют 1 мл 0,001 М моногидрохлорида (.-аргинина. Снова пропускают через суспензию азот, закрывают пробирки пробками, ипкубируют в течение 2 ч и нагревают 15 мин при 100'С.
После удаления клеток цеитрифугироваиием определяют в надосадочной жидкости аргииин по методу Розенберга и др. 177): смешивают 1 мл пробы с 1 мл 3 н. ХаОН, 2 мл проявляющего раствора (разд. 20.4.4) и 6 мл воды; через 30 мип сравнивают пробирки с контрольной пробой без аргинина, используя колориметр с зеленым светофильтром (540 нм); сравнивают показания с данными, полученными для неинокулированной контрольной пробы, содержащей аргинии. Положительная реакция: исчезновение части или всего аргинина.
20.1.6. Разрыв ароматического кольца [88] Культуру выращивают на синтетической среде, содержащей 0,17з п-гидроксибензоата натрия в качестве источника углерода, а также на агаризованном дрожжевом экстракте для определения того, является ли фермент конститутивным или индуцибельным. Соскабливают выросшие клетки с агара и суспеидируют их в 2 мл 0,02 М трис-буфера, рН 8,0. Встряхивают суспензию с 0,5 мл толуола и добавляют 20 мкмолей (3,5 мг) протокатехоата натрия. Появление желтой окраски в течение нескольких минут означает расщепление ароматического кольца в мета-положении. При отсутствии изменения окраски суспензию встряхивают в течение часа при 30'С. Добавляют 1,0 г (ИН4)з50ь 1 каплю 1,0Ъ-ного нитропруссида (питроферрицианида) и 0,5 мл нашатырного спирта (удельный вес 0,880 или 28— 307,-ный раствор).
Окрашивание в пурпурный цвет оз- 13 ЧАСТЬ У СИСТЕМАТИКА начает наличие расщепления в орто-положении. Примеры: расщепление в мета-положении — Ряеис(отопая асЫосогапя; расщепление в орто-положении — Ряеис(отопая 11иогеясепя; отрицательный результат — Еяс(тес(сй(а соВ. 20.1.7. Арилсульфатаза К стерильной жидкой среде добавляют с соблюдением правил асептики достаточное количество стерилизованного фильтрованием 0,08 М раствора дисульфата трикалийфенолфталеина (1СЬ) ВюсЬепнса!з, С1ете! апд, ОЬ(о) до конечной концентрации 0,001 М. Оптимальными для синтеза арилсульфатазы являются среды, содержащие в качестве единственного источника серы метионин; такие источники серы, как сульфат, сульфит, тиосульфат или цистеин, могут подавлять синтез фермента 114, 801.
Среду ннокулируют и инкубируют в течение 7 дней, затем добавляют по каплям 1 н. ЫаОН или 1 М ЫаяСОА. Положительная реакция; окраска от бледнорозовой до светло-красной. Неинокулированная контрольная проба при такой же обработке остается бесцветной. Примеры: положительный результат — Рго1еия ге1- 1йегй отрицательный — СЬготосас1ег(ит ого1асеит. 20.1.8. Бацнтрациновый тест Используют стерильные имеющиеся в продаже диски для дифференциации, а не определенна чувствительности (Р11со 1.аЬога1ог1ез, Ре1го11, М(СЬ.; ВВ1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
