Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 8
Текст из файла (страница 8)
После того как поверхностный слой затвердеет, отмытую суспензию испытуемого микроорганизма засевают на пеболыпом участке агара в чашке. (В одной чашке можно испытывать несколько штаммов.) Инкубацня продолжается несколько дней. Положительная реакция: рост бактерий на ннокулнровапном участке и появление зон просветления за счет деполпмернзации гранул ПГБ. Примеры: положительный результат — Ряеиг(отолая (етогйпе1; отрицательный — Ряеиг(огпопая асЫООО- гппя. члсть ч.
систгмлтикл 20.1.51. Пноцпаннн и другие феиазиновые пигменты Инокулируют косяк со средой А (равд. 20.3.!) и затем просматривают его через 24, 48 и 72 ч. Положительная реакция: появление пигментов, диффундирующих в агар и окрашивающих его. В некоторых случаях пигменты могут лишь слабо растворяться в воде и осаждаться в виде кристаллов в среде.
Примеры; пиоцианин — голубая окраска среды— Рзеийотопаз аегиатоза; феназин-1-карбоксильная кислота — желто-оранжевая окраска, возможна кристаллизация в колониях и окружающих колонии участках среды — Рзеийотопаз аегогас1епз; оксихлорорафнн— бледно-желтая окраска среды — Рзеиг)отопаз сп!отогарЙ1з. Хлорорафин очень слабо растворим, он скапливается в виде отдельных зеленых кристаллов в участках роста на утолщенном конце косяка — Р.
сл)огогарЫз. 20.1.52. Споры 1эндоепоры) Окрашнвание спор описано в равд. 3.3.7. Среды для роста культур должны содержать достаточные количества ионов Са'" и Мп''. Инокулируют среды с углева- дами и без них и изучают культуры различных возрастов. Примечание; не следует ошибочно принимать за эндоспоры гранулы включений (например, ПГБ). Когда обнаруживают спороподобиые структуры, необходимо подтвердить наличие спор в опыте с нагреванием. Пробирку с бульоном инокулируют выросшей на твердой или жидкой среде культурой, в которой предполагают спорообразование.
При этом стараются избегать контакта инокулята со стенками пробирки. Пробирку помещают в водяную баню при 80'С вместе с контрольной пробиркой, снабженной термометром, в которой содержится неинокулированный бУльон. Необходимо убедиться в том, что уровень воды в бане выше уровня бульона. Инкубнруют 10 мин начиная с того момента, когда температура достигнет 80'С. Пробирку охлаждают, инкубируют при оптимальной температуре и определяют наличие роста. 17римечание: некоторые эндоспоры, например у определенных штаммов С1оз1пЖипз М. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЬО1и(1аит, при 80'С могут погибнуть; в этом случае при определении устойчивости спор к нагреванию используют более низкие температуры (например, 75 или 70'С).
Для подтверждения спорообразования применяют также «поппинг-тест» (равд. 3.3.7). Некоторые виды Уосагс((а образуют «хламидоспоры», или «микроцисты», которые могут выдерживать температуру 80'С в течение нескольких часов и все же не являются истинными эндоспорами. 20.1.53. Гидролиз крахмала Готовят агаровую среду, на которой культура способна хорошо расти, добавляют 0,2% растворимого крахмала н кипятят. Среда не должна содержать глюкозы, так как в ее присутствии гидролиз крахмала может ингибнроваться 193]. Среду стерилизуют при 115'С в течение 10 мнн и делают посев одним штрихом через центр чашки с крахмальным агаром. После инкубации агар заливают раствором иода (можно использовать нод, применяемый для окраски по Граму).
Положительный тест: появление бесцветного участка вокруг зоны роста. Примеры: положительный результат — ВасИив зиаИ1в; отрицательный — ЕзсйепсЫа со(!. 20.1.54. Диагностические тесты с использованием агаровой среды, содержащей три сахара и железо Скошенный агар, содержащий три сахара и железо (равд. 20.3.34), ннокулируют прямой иглой. Вначале засевают уколом до дна пробирки утолщенный конец косяка, а затем иглу извлекают и наносят штрихи на поверхность агара. Пробирку закрывают ватной пробкой нлн чем-то подобным, чтобы обеспечить доступ воздуха к среде. Чашки просматривают после инкубацни при 37'С в течение 18 — 24 ч.
При этом можно получить три типа данных: 1, Брожение сахаров Кислая реакция среды в утолщенной части агара 1желтая окраска) н щелочная в скошенной (красная ок- ЧАСТЬ Ч. СИСТЕМАТИКА раска) свидетельствуют о сбраживании глюкозы, но не сахаровы или лактозы.
Кислая реакция в утолщенной части агара и кислая реакция в скошенной (равномерно желтый косяк) свидетельствуют о сбраживании лактозы и (или) сахаровы. Шелочная реакция среды в утолщенной части агара п щелочная реакция в скошенной (равномерно красный косяк) свидетельствуют об отсутствии сбраживания. 2. Оброзованив газа Об образовании газа свидетельствуют пузырьки в утолщенной части косяка.
Большое количество газа может разорвать агар или выбросить его вверх. 3, Образование сероводорода Об образовании сероводорода свидетельствует почернение утолщенной части косяка в результате реакции НТБ с сульфатом железа(11)-аммония, продуктом которой является сульфид железа. 20.1.55. Уреаза Метод 1. Инокулируют скошенный агар Кристенсена с мочевнной (равд. 20.3.12) и инкубируют.
Положительный результат: появление красно-фиолетовой окраски. Примеры: положительный результат — РтоГвив ои1- йатЬ; отрицательный — Езслепс(ма со(Е Метод 2 (47!. Этот метод используется для микроорганизмов, не растущих на агаре Кристенсена с мочевивой. Готовят раствор, содержащий: 0,1065'/в БЭС-буфера (!ч(,Х-бис-(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота; 1С(ч(РЬатщасен(!Са1з, С!ече!апб, ОЫо),2,0в~з мочевнны и 0,0014!А фенолового красного, рИ 7,0. Стерилизуютфильтрованием и разливают с соблюдением правил асептики по 2,0 мл в небольшие пробирки.
Бульонную культуру центрифугируют и к клеткам добавляют сзерильную дистиллированную воду или физиологический раствор для получения густой суспензии. В пробирку со средой, содержащей мочевину, добавляют 0,5 мл клеточной суспензии. Инокулнруют также контрольную среду без мочевнны. Пробирки инкубируют 24 ч. Положительный тест: появление красво-фиолетовой окраски. 44 ьь овщля хлнлктвгнстикл 20.1.56. Реакция Фогес — Проскауера Инокулируют две пробирки с бульоном МВЧР (разд. 20.3.24). Одну пробирку инкубируют при 37'С, а другую — при 25'С.
Через 48 ч 1 мл культуры переносят в другую пробирку, добавляют 0,6 мл 57,-ного (вес(объем) а-нафтола, растворенного в абсолютном зтаноле, и тщательно перемешивают. Затем добавляют 0,2 мл 40%-ного водного раствора КОН. Вновь хорошо перемешивают и инкубируют, установив пробирку наклонно для увеличения площади поверхности среды (реакция зависит от доступа кислорода).
Пробирку просматривают через 15 и 60 мин. Положительный тест: окрашивапне поверхности среды в интенсивный красный цвет. Примеры: положительный результат — Еп!сгоЬас!ег аегойепез; отрицательный — Езспег!спш соП. 20.1.57. Потребности в факторах Х и У Чашки с агаром, содержащим соево-казеиновый гидролизат (равд. 20.3.31), инокулируют следующим образом. Стерильный ватный тампон смачивают в суспензии, отжимают на стенке пробирки для удаления лишней жидкости и проводят им по всей поверхности чашки (не повреждая агара). Используют стерильные бумажные полоски, пропитанные Х-фактором (гемом) или Ч-фактором (ЫАО, ЭРЫ), которые можно приобрести у Р!!со ).аЬога!ог!ез, (ле!го!1, М!сЬ.
или ВВ(. М!сгоЫо!оцу Буз!етз, Соскеузч!1!е, Мд. Полоску с Х-фактором помещают предварительно прокаленным в пламени пинцетом на поверхность инокулированного агара. На расстоянии 2 см от нее помещают полоску с Ч-фактором. Чашки инкубируют 1 — 2 дня.
Результаты интерпретируют следующим образом. Наличие роста только вокруг одной полоски (с Х- или У-фактором) означает потребность в соответствующем факторе. Наличие роста только на участке между двумя полосками означает потребность в обоих факторах.
Наличие роста на всей поверхности чашки означает, что микроорганизм не нуждается ни в одном из факторов. Примеры: положительная реакция и на Хь и на Ч-фактор — НаеторЫ!из паегпо1убсиз; положительная 45 члсть м системлтикА реакция только на 17-фактор — Наетор/44!из рага4п)1иепгае; отрицательная реакция и на Х-, и на Ъ'-фактор— Езс/4ег(сл1а со!1. 20.2. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ТЕСТЫ 20.2.1. Определение метаболитов методом газовой хроматографии ((71; см. также равд. 16.3.4) Кислоты и спиртьс Методики, описанные ниже, были разработаны для идентификации анаэробов, но ях можно также использовать для аэробов и факультативно анаэробных микроорганизмов.
1 мл культуральной среды, содержащей глюкозу или другие сбра>киваемые углеводы, помещают в пробирку размером 12Х75 мм и подкисляют 0,2 мл 50%-ной (по объему) Н2504, подкисленные образцы можно хранить для последующего анализа. Добавляют 0,4г )4)аС! и 1 мл диэтилового эфира. Пробирку закрывают корковой пробкой и ее содержимое перемешивают, осторожно переворачивая пробирку около 20 раз для перехода свободных жирных кислот в эфирную фазу.
Смесь цептрифугируют несколько минут и отделяют верхний слой эфира от слоя воды. Не следует удалять слишком много эфира, чтобы вместе с ним не попала вода. Эфирный слой помещают в другую пробирку размером 12Х75 мм и добавляют безводный СаС!т (4— 20 меш) в количестве, равном примерно '/4 объема эфира, для удаления растворенной воды. Отбирают 14 мкл н вводят в газовый хроматограф для анализа короткоцепочечных летучих жирных кислот н спиртов. Неинокулированную среду подкисляют, экстрагируют и используют в качестве контроля.
Пировиноградная, молочная, фумаров 4н и янтарная кислоты нелетучи, н поэтому для анализа методом газовой хроматографии их следует перевести в метиловые эфиры. 1 мл культуры помещают в пробирку размером 12Х75 мм и добавляют 2 мл метанола и 0,4 мл 50')4-ной Нз504 Вместо метанола можно добавить 2 мл метанольного раствора трехфтористого бора (БГз), который 46 ВЬ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА продается любой торговой организацией, поставляющей реактивы для хроматографии. Смесь нагревают 30 мни при 60'С.
В пробирку добавляют 1 мл воды и 0,5 мл хлороформа, плотно закрывают н осторожно переворачивают пробирку приблизительно 20 раз. Удаляют слой хлороформа (нижний слой) и вводят 14 мкл в газовый хроматограф, Рекомендуется использовать газовый хроматограф с детектором по теплопроводности (ТП). Можно использовать пламенно-ионизационный детектор (ПИД), однако при этом нельзя обнаружить муравьиную кислоту. Применяют колонку из нержавеющей стали, алюминия или стекла длиной 1,8 м и внутренним диаметром 6 мм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
