Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 11
Текст из файла (страница 11)
20.2.5. Множественная инокуляцня с помощью бархата Метод множественной инокуляции с помощью бархата предназначен для определения потребностей в питании большого числа штаммов. Ниже описана методика, с помощью которой можно определить способность 267 штаммов псевдомонад к использованию 146 различных органических соединений в качестве источников углерода и энергии (88). Готовят агаровую среду следующего состава: 40 мл буфера КатНРО4 — КН,РО, (1,0 М, рН 6,8); 20 мл безвитаминной минеральной основной среды Хатнера (разд.
20.3.18); 1,0 г (НН,)т504, 20 г агара и 940 мл дистиллированной воды. В среду добавляют 0,1 — 0,2% испытуемого источника углерода и разливают ее по чашкам Петри. Агар в стерильных чашках подсушивают инкубацией при 37'С в течение 2 — 3 дней. Чашки хранят до применения (не больше 4 — 5 нед) в пластмассовых пакетах при комнатной температуре. Матричную чашку готовят, высевая на агаровую среду, содержащую 0,5')Б дрожжевого экстракта, методом <сзаплаток» (инокулируют лишь небольшие участки) до 23 различных штаммов бактерий.
После того как появляются колонии, с помощью бархата методом отпечатков, впервые описанным Ледербергами (54), засевают вспомогательные чашки. См. также равд. 13.6.2. Согласно этому методу, кусочек стерильного бархата прикрепляют к цилиндрической болванке с диаметром, немного меньшим диаметра чашки Петри, и осторожно прижимают его ворсинками к агару в матричной чашке. Затем таким же образом прижимают его к стерильному агару в других чашках.
В результате перепечатывания колонии во вспомогательных чашках имеют точно такое же расположение, как и в матричной. От одной матричной чашки можно инокулировать 9 вспомогательных чашек. После появления признаков роста культур во вспомога- часть ч. систематика тельных чашках каждую из них используют для посева методом отпечатков в 9 других чашек с различными соединениями углерода, а затем в последнюю чашку с агаром, содержащим дрожжевой экстракт, для того чтобы проверить, имел лн место перенос всех штаммов. Чашки просматривают через 48 и 96 ч и результаты учитывают следующим образом: рост не лучше чем на контрольной чашке без источника углерода 0; хороший рост +; рост недостаточно хороший, однако существенно лучший чем на контрольной чашке ~-; запоздалый рост нескольких колоний на месте мазка, которые предположительно возникли из мутантов, содержавшихся в инокуляте +М.
Когда штаммы с сильно различающимися потребностями в питательных веществах высевают на одну чашку, может происходить перекрестное питание (за счет диффузии питательных веществ, продуцируемых одним штаммом, к примыкающим колониям других штаммов, что приводит к ложноположительной реакции) или один штамм может мешать росту другого.
Поэтому после первоначального произвольного скрининга проводят второй скрининг, используя иное расположение колоний штаммов в матричной чашке. 20.2.6. Ауксанографический метод определения потребностей в питательных веществах Расплавленную основную агаровую среду (при температуре 45 — 50'С) без источников углерода инокулируют отмытой суспензией испытуемого микроорганизма. Погружают края стерильных дисков из фильтровальной бумаги в стерильные растворы различных соединений углерода, позволяя жидкости импрегнировать диск.
Эти диски можно сразу же положить на поверхность инокулированного агара в чашках, или же их можно хранить до использования в высушенном состоянии в стерильном контейнере. Диски располагают по краю чашки Петри (3 — 4 диска на чашку) или на больших поверхностях инокулированного агара (например, разлитого в пирексовые противни) на соответствующем расстоянии друг от друга. После иикубации проверяют наличие зон роста (помутнения) вокруг диска, свидетельствую- 88 20. ОЬЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА щих об использовании источника углерода.
В некоторых случаях рост наблюдается только в виде линии между двумя дисками; это, по-видимому, означает, что организму требуются оба источника углерода. Рост по всей поверхности агара может быть вызван слишком густым посевом; в таком случае следует применять более разбавленный ннокулят. 20.2.7.
Нитрогеназная активность и азотфиксация (см. также равд. 17.6.10) Метод, основанный на восстановлении ацетилена, позволил относительно легко по сравнению с методами включення '21ч2 определять нитрогеназную активность у бактерий, хотя методы включения '%2 по-прежнему остаются наиболее точными. Принцип метода восстановления ацетилена основан на способности нитроге~азного комплекса ферментов восстанавливать ацетилен до этилена. Испытуемый микроорганизм культивируют в условиях, способствующих образованию нитрогецазы.
Затем в сосуд с культурой добавляют газообразный ацетилен и после инкубации определяют образование этилена. Контрольные культуры на средах, содержащих ионы аммония, которые подавляют синтез нитрогеназы (за исключением 1ХИгоЬ1ит), образуют мало этилена или вообще не образуют его. Подробное описание метода восстановления ацетилена н его применения приводится в ряде работ 14, 5, 11). Важно культивировать организмы в условиях, способствующих синтезу нитрогеназы.
Это требует использования среды, не содержащей связанного азота, но содержащей нужный источник углерода н энергии, а также источник молибдена. Кроме того, необходимо обеспечить соответствующую газовую атмосферу. Для анаэробных организмов, таких, как С1оз1пйит разтеиг2аиит, необходимы анаэробные условия. Анаэробные условия благоприятны также для синтеза нитрогеназы у факультативных анаэробов, таких, как Йейь1еПа, Многие азотфиксаторы для роста и образования энергии нуждаются в кислороде, но устойчивость к кислороду для роста в условиях азотфнксации у таких организмов сильно различается.
Например, Агозр1г271ит луч- 59 ЧАСТЬ Ю СИСТЕМАТИКА ше всего растет в условиях азотфиксации прн концентрации кислорода около 1% и не растет вообще на воздухе (21$ кислорода), тогда как АЕС1обае1ег является аэротолерантным. Однако даже аэробные азотфиксаторы обычно лучше фиксируют азот прн более низком уровне кислорода, чем в воздухе. Аэробные азот4икеаторы Микроорганизмы выращивают на (или в) солевой среде (твердой нли жидкой) в пробирках, закрытых ватными пробками, или в пенициллиновых флаконах.
Примером такой среды является среда Берка для Аео1оЬас1ег (равд. 20.3.9). Иногда для инициации роста желательно добавлять небольшое количество источника связанного азота (например, 0,0001 — 0,005ь/ь дрожжевого экстракта). В конце инкубационного периода ватную пробку заменяют стерильной пенициллиновой пробкой. Газообразный ацетилен собирают (внимание: огнеопасно!) в вытяжном шкафу следующим образом 111]. В пробирку, наполовину заполненную 15 мл воды, добавляют кусочек (около 1 г) карбида кальция.
Пробирку немедленно закрывают пробкой с отверстием, через которое она с помощью резиновой трубки соединяется с химическим стаканом с водой, куда погружен конец трубки. После того как ацетилен вытеснит воздух из трубки, но все еще продолжает образовываться, его отбирают из трубки шприцем с иглой для подкожных инъекций № 26. Ацетилен вводят в сосуд с культурой через резиновую пробку до концентрации 10ь/ь (по объему). Через различные промежутки времени ннкубации отбирают шприцем пробы газа по 1 мл из сосуда с культурой и проверяют наличие этилена методом газовой хроматографии (см.
ниже). Факультативно анаэробные и анаэробные бактерии Очищенный от кислорода и пропущенный через фильтр газообразный азот пропускают через стерильную культуральную среду, помещенную в пробирки, и одновременно инокулируют среду. Пробирки закрывают стерильными пенициллиновыми пробками. Для факультативно анаэробных бактерий, таких, как К1еЬэ1е(1а, бо ЗО. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА строго анаэробные условия не обязательны, так как клетки сами могут использовать небольшие остаточные количества кислорода и создавать высокоанаэробные условия. Примеры сред я приведены в разд. 20.3.35 (для К(ебз(е/(а), 20,3.13 (для С(оз(гй((ит раз(еипапит) и 20.3.16 (для Вас(1- 1из). Можно также использовать пробирки Панкхурста объемом 40 мл (Лз(е!! !.аЬога1огу Яегч!се Со., 1.Ы,, Еопбоп 5. Е.
6, Епп1апд) (23). Пробирка Панкхурста (рис. 20.3) состоит из двух пробирок (одна из которых больше, а другая меньше по размеру) и горизонтальной соединительной трубки, за- рис. Яо.з. пробирка паннкурполненной несорбирующей ста. ватой в качестве фильтра 1 — большая пРобиРка (1.9х для 1 а за Е большукз про х, см) с кУль УРой; х — соединительная трубка бирку наливают 5 — 10 мл (ОЗХ1,6 см) с непоглокультуральной среды и вре- щащщей ватой в качестве менно закрывают ватной фильтра для газа' ют автоклавированием.
Ох- ской ватой для щелочного лажденную среду инокули- пирогаллола. руют и с соблюдением правил асептики закрывают обе пробирки стерилизованными пенициллиновыми пробками. Через систему пропускают газообразный азот (иногда в этой стадии нет необходимости; см.[11)), вставив в обе пробки иглыдля подкожных инъекций, одну — для ввода газа, другую— для вывода. После пропускання газа иглы убирают и в меньшую пробирку вносят 0,75 мл насыщенного раствора пирогаллола, а затем 0,75 мл раствора, содержащего 10% (вес/объем) Ь)аОН и 15/о (вес/объем) КзСОз.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
