Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Молодую бульонную культуру испытуемого микроорганизма центрифугируют и надосадочную жидкость сливают. Клетки суспендируют в ФСБ и вновь центрифугируют. К осадку добавляют небольшое количество ФСБ, чтобы получилась густая суспензия клеток. С помощью алмазного или карбидно-вольфрамового карандаша очерчивают круг диаметром '/4 размера предмстного стекла. Стекло тщательно обезжиривают и внутри окружности делают мазок одной петлей бактериальной суспензии. Мазок высушивают на воздухе без нагревания, помещают предметное стекло на 1 мин в сосуд с 95272-ным этанолом, вынимают его и сушат на воздухе. На мазок капают несколько капель рабочего раствора флуоресцирующей антисыворотки.
Распределяют ЧАСТЬ Ч. СИСТЕМАТИКА антисыворотку по мазку аппликатором, не касаясь мазка. Стекло препаратом вверх помещают в чашку Петри, к крышке которой прикреплен влажный кружок фильтровальной бумаги; такая чашка служит влажной камерой, в которой предотвращается высыхание антисыворотки. Инкубнруют прн 37'С 15 — 20 мин. Избыток антисыворотки сливают, наклоняя предметное стекло над фильтровальной бумагой. Затем стекло помещают в сосуд с ФСБ на 1О мин, периодически поднимая н опуская.
Эту процедуру повторяют еще 2 раза, используя каждый раз сосуд со свежим ФСБ. После третьего погружения в ФСБ стекло опускают один раз в сосуд с дистиллированной водой для удаления ФСБ, сразу же промокают (не вытирают) фильтровальной бумагой и высушивают. На мазок наносят небольшую каплю забуференного глицерина (разд. 20.4.2) и накрывают его покровным стеклом. Просматривают мазок в люминесцентный микроскоп (разд. 1.4) при большом увеличении с масляной иммерсией или без нее. Когда смотрят с иммерсией, применяют только нефлуоресцирующее масло (равд, 1.5). Параллельно с окрашиванием испытуемого микроорганизма по той же методике готовят две контрольные пробы. Одну с рабочим раствором флуоресцирующей антисывороткн и известной бактерией, а другую с испытуемым микроорганизмом и раствором флуоресцирующей нормальной сыворотки.
Степень флуоресценции первой контрольной пробы составляет 4+, во второй пробе не должно быть флуоресценции. Примечание: при рассматривании мазков в люминесцентный микроскоп следует часто менять поле, так как прн наблюдении одного и того же поля флуоресценция быстро затухает (приблизительно через !5 с). Наиболее яркая флуоресценция наблюдается в тот момент, когда в фокус объектива попадает новое поле. Примечание: следует всегда пользоваться свежеприготовленным рабочим раствором флуоресцирующей антисыворотки. Неразведенная исходная сыворотка стабильна при хранении в холодильнике при температуре ниже +8'С.
ЗО, ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 20.3. СРЕДЪ| И РЕАКТИВЫ 20.3.1, Среда А !311 Понтон 20,0 г Агар (сухой) Глицерин 10,0 мл Дистиллированная Ка50а (безводный) !0,0 г вода МйС!а (безводный) 1,4 г Компоненты смешивают и доводят рН до 7,2. Смесь кипятят для растворения агара и стерилизуют автоклавироваиием при !21'С в течение 1б мин. Охлаждают в наклонном положении. 20.3.2.
Аргининовый бульон Нивена и др. !67) Дрожжевой вкстракт 5,0 г Глюкоза (декстроза) 0,5 г Трпптон 5,0 г 1.-аргиинн НС! 3,0 г КаНРОа 2,0 г Дистиллированная 1000 мл вода (Примечание: хотя в оригинальной методике используется 13-аргиннн, можно также добавлять 1.-форму 131.) Компоненты смешивают и растворяют при нагревании. Доводят рН до 7,0, кипятят, фильтруют и стерилизуют автоклавированием. Компоненты смешивают и растворяют при нагревании. Доводят рН до 7,0, кипятят, фильтруют и стерилизуют автоклавированием.
20.3.4. Нолужидкая безазотная среда с малатом для Аголр(г(Пиит !301 КНаРОа 0,4 г 1-яблочная кислота (или КаНРОа О,! г малат натрия) М250а 7НаО 0,2 г Бромтимоловый синий, О,бав-ный спиртовой МаС! О,! г раствор СаС1а 2НаО 0,025 г Агар ГеС1а.бНаО 0,017 г Дистиллированная вода )4ааМоОа 2Н,О 0,002 г 3,58 г (5,00 г) 5,0 мл 1,75 г 1000 мл 20.3.3. Аргининовый бульон Эванса и Нивена !331 Трнптон 10,0 г 1.-аргиннн НС! 3,0 г Дрожжевой экстракт 5,0 г Дистиллированная !000 мл )ЧаС! 5,0 г вода ЧАСТЬ и, СИСТНМАТИКА Компоненты смешивают и доводят рН до 6,8 с помощью КОН. Стерилизуют автоклавированием.
Примечаниеч некоторые штаммы АгозрггИит нуждаются в добавлении дрожжевого экстракта (0,005»то) в качестве источника витаминов. 20.3.5. Среда Б (51) Панкреатический гид- !0,0 г ролизат казеина Пептнческий гндроли- 10,0 г зат животных тканей !15Р 1,5 г 1,5 г 14,0 г 1000 мл К»НРО» МП50» ТН»О Агар (сухой) Дистиллированная вода Компоненты смешивают и доводят рН до 7,2.
Кипятят для растворения агара и стерилизуют автоклавированием при 121'С в течение 15 мин. Охлаждают в наклонном положении. 20.3.6. Агар с желчью (3) Экстракт из говяжьего мяса 10,0 г Пелтон !0,0 г 51аС1 5,0 г Дистиллированная вода 1000 мл 20.3.7. Кровяной агар К стерильной расплавленной и охлажденной до 45— 50'С основе кровяной агаровой среды (равд.
20.3.31) Аобавля!от бо!о (по объему) стерильной дефибриниро- 70 Компоненты смешивают и растворяют при нагревании. Доводят рН до 8,0 — 8,4 добавлением 10 н. 1чаОН. Кипятят 10 мин, фильтруют, доводят рН до 7,2 — 7,4 и добавляют 10,0 г дегидратированной бычьей жеччи. При необходимости вновь доводят рНдо7,2 — 7,4. Добавляют 15,0 г агара, кипятят и стерилизуют автоклавированием. Охлаждают до 55'С и добавляют с соблюдением правил зсептики 50 мл стерильной сыворотки крови. Перемешивают и разливают в чашки.
Примечание: 1о»!о дегидратированной бычьей желчи = 10о1о (по объему) жидкой желчи; для получения 40о!о-ного агара с желчью берут 4о»!о дегидратированной бычьей желчи. та. овщля хлрлктг2ристикл 20.3.8. Среда Борда н Холдинга 1201 4чн4Н2Р04 К2НР04 Дрожжевой экстракт Бромтнмоловый си. ннй 0,5 г 0,5 г 0,5 г 0,03 г Раствор минеральных 20 мл элементов (равд. 20.3.181 Агар 5,0 г Дистиллированная 880 мл вода Сначала растворяют первые три компонента в дистиллированной воде, а затем добавляют индикатор и раствор минеральных элементов. Доводят рН до 7,2.
Добавляют агар и смесь кипятят до растворения. Разливают по 9,0 мл в пробирки и стерилизуют, поместив на мгновение в автоклав с давлением водяного пара 1,54 ° 102 Па, Охлаждают до 45 — 50'С. Во время автоклавировання может образоваться осадок, который при охлаждении растворяется, В каждую пробирку добав- 71 ванной крови, хорошо перемешивают и разливают в чашки. Чашки с пузырьками воздуха или пеной на поверхности не используют. Обычно предпочитают овечью или кроличью кровь. Лошадиная кровь может давать искаженные гемолитическне реакции. Донорская кровь человека, хранящаяся в банках крови, содержит цитрат н глюкозу; цнтрат может быть ингибитором роста некоторых бактерий, а глюкоза может давать ложную реакцию с появлением зеленой окраски в отсутствие истинного а-гемолиза. Кровь, используемая для приготовления кровяного агара, не должна содержать антибиотики пли хнмиотерапевтнческие препараты. Дсфибриннрованную кровь готовят следующим образом: в стерильных условиях отбирают кровь шприцем с иглой утаи 18 (для предотвращения гемолиза, вызываемого механическим разрушением) и немедленно переливают ее в стерильную колбу, в которую помещен слой стерильных стеклянных шариков (диаметром около 3 мм).
Колбу встряхивают в горизонтальной плоскости в течение 1О мин. Фибрин, образовавшийся во время свертывания, остается на шариках. Надосадочную жидкость, содержаьпую клетки крови и сыворотку, сливают в стерильный сосуд и хранят в холодильнике. чАсть у. систвмАтикА лают 1,0 мл 5с/е-ного раствора углевода (обычно глюкозы), заранес простсрилизованного фильтрованием.
Среду перемешивают и оставляют охлаждаться. 20.3.9. Модифицированная среда Бйрка [731 Раствор А: МяБО, 7Н,О 0,2 г СаБО, 2Н,О 0,1 г РеБО4 7НтО 0,005 г 0,00024 г 10,0 г 500 мл ЫатМоОь 2Н,О Глюкоза Дистиллированная вода Раствор Б: Калий-фосфатнмй буфер, 0,005 М, рН 7,1 500 мл Растворы А и Б автоклавируют отдельно и после охлаждения смешивают их в соотношении 1: 1. 20.3.10. Предварительно восстановленный бульон с рубленым мясом [7) Рубленая говядина (используют простую говяди- 500 г иу без жира) вли конина Дистиллированная вода 1000 мл "г1аОН, 1 и. 25 мл Смесь кипятят в колбе с отводом (для предотвращения перекипания).
В 1-л колбу наливают 750 мл бульона, а в 750-мл колбу 500 мл бульона. Кипятят до изменения окраски ресазурина от розовой до бесцветной. 72 Мясо измельчают, предварительно удалив жир и пленки, смешивают его с водой и ХаОН и доводят смесь до кипения, постоянно перемешивая. Охлаждают до комнатной температуры, снимают с поверхности жир и фильтруют.
Отдельно сохраняют осадок и фильтрат, К фильтрату добавляют дистиллированную воду в количестве, необходимом для восстановления первоначального объема (1 л), и затем следующие компоненты: Триптиказу 30,0 г Дрожжевой экстракт 5,0 г КзНРОт 5,0 г Раствор ресазурина 10,0257э) 4,0 мл 20 овшля хлрактегистика Снимают колбу с огня и вместо отвода устанавливают форштосс с двумя отводами и газоотводной трубкой в одном из них. Во время охлаждения среды до комнатной температуры в ледяной бане через нее пропускают очищенный от кислорода углекислый газ.
На 1 л среды добавляют следующие ингредиенты: 0,5 г 1О мл 0,2 мл Цис тени Раствор темина (равд. 20,3 28) Раствор витамина К, (равд. 20.3,28) 20.3.11. Цнтратный агар Кристенсена 126] 3,0 г 0,2 г 0,5 г О,! г 1,0 г 5,0 г 0,08 г 0,0!2 г !5,0 г !000 мл КНзРОз г!аС! Тиосульфат натрия Феноловый красный Агар Дистиллированная вода Цитрат натрия Глюкоза Дрожжевой экстракт Гндрохлорид цистенна Цитрат железа(11)- аммония 0,4 г Компоненты смешивают и доводят рН до 6,7. Стерилнзуют автоклавированием. Охлаждают в наклонном положении, так чтобы высота застывшего столбика составляла 2,5 см, а длина скошенной части агара была бы равна 3,8 см. ,Доводят рН до 7,2, добавляя 8 н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
