Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Раствор экстрагируют приблизительно равными объемами хлороформа до тех пор, пока хлороформ не станет бесцветным (обычно 6 — 8 раз). Полученный водный раствор метнлового зеленого хранят прп 4 С. Краситель можно добавлять в среду для определения ДНКазы перед автоклавированием или его стерилизуют фильтрованием и добавляют с соблюдением правил асептики в автоклавированную среду прн 45 †50 'С. 20.4.10.
Раствор Несслера К! о,о г дистиллированная вода, 5,0 мл безаммиачяая К! растворяют в воде и добавляют насыщенный раствор НнС)з (около 2,0 г в 35 мл) до образования осадка, свидетельствующего об избытке НКС1з. Затем добавляют 20 мл 5 и. ХаОН и смесь разбавляют до 100 мл. После оседания осадка сливают прозрачную надосадочную жидкость. 20.4.11.
Использование нильского голубого сернокислого для окрашнвания жиров !12) Раствор нильского голубого сернокислого. Готовят насыщенный водный раствор нильского голубого серно- кислого. Добавляют 1 и. МаОН по каплям до прекращения образования осадка. Фильтруют и промывают осадок дистиллированной водой при рН 7,5. Высушивают и хранят до использования. Окрашивание жира. Готовят насыщенный раствор оксазннового основания нильского голубого сериокислого, используя приготовленный ранее сухой осадок.
Смешивают 1 мл раствора с 10 мл жира 1триптопионина, трибутнрнна, трикапроина, трикаприлина, триолеина, говяжьего сала, молочного жира, кокосового, кукурузного, хлопкового масла, свиного жира, льняного или оливкового масла). При необходимости смесь помещают в подогреваемую водяную баню для поддержания жира в жидком состоянии в течение всей последующей процедуры промывания, то. ОБШАя хАРАктеРистикА Процедура промыаапия. В случае жиров, находящихся прп комнатной температуре в жидком состоянии, к смеси красителя и жира в делительной воронке добавляют 2 объема диэтнлового эфира. Эфирный красный слой отделяют от слоя воды и несколько раз промывают его водой. (Осгоролсно: эфир легко воспламеняется! Все процедуры с эфиром проводят в вытяжном шкафу, избегая огня или искр, в присутствии которых может произойти взрыв.) Наконец, отделяют эфирный слой, в котором находится жир, и выпаривают эфир.
Отделяют жир от остатков воды, стерилизуют его автоклавированием и хранят в холодильнике. Перед применением добавляют 1 мл окрагвенного жира к 10 мл расплавлснной стерильной основной среды, хорошо перемешивают н разливают в чашки. В случае жиров, находящихся прп комнатной температуре в твердом состоянии, смесь красителя с жиром промывают несколько раз горячей водой и затем разливают жнр в расплавленный нейтральный 0,5о(е-ный агар — по 1О мл жира на 90 мл агара. Стернлизуют автоклавированием. Перед использованием жир растапливают и вносят 1 мл жировой эмульсии в 20 мл расплав.
ленной стерильной основной среды. Смесь хорошо перемешивают и разливают в чашки, 20А.12. Реактивы для теста на присутствие нитритов Метод 1. Расгор Л: М-(1-нафтнл)-втнленднамннднгндроллорнд (о!Кше 0,02 г Снеш!са! Со.) НС1, !,б н.
раствор 100 мл Смесь рястворяют, осторожно нагревая в вытяжном шкафу, Раствор Б: Сульфаннловая кислота 1,0 г НС(, 1,З н. раствор 100 м Растворяют, осторожно нагревая на слабом огне. Реактив получают, смешивая равные объемы растворов А и Б непосредственно перед использованием, ЧАСТЬ Ч. СИСТЕМАТИКА Метод Ги Раствор А: М,М-диметил-!-нафтиламиндигидрохлорид (5(кша 0,6 г Сиеш(са( Со.) или нафтиламин) (0,5 г) «. СН СООН 100 мл Растворяют, осторожно нагревая в вытяжном шкафу.
Раствор Б: Сульфаниловая кислота 0,8 г 5 и. СнзсООН 100 мл Растворяют, осторожно нагревая в вытяжном шкафу. Осгорозгсно: Управление по профессиональной безопасности и здоровью (ОЯНА) объявило а-иафтиламин канцерогеном. Хотя )к)-(1-нафтил)-этилендиамин и Х,М-днметил-)гнафтзгламин не включены в список канцерогенов, их также можно считать опасными ввиду структурного сходства с а-иафтиламином. Поэтому следует соблюдать все предосторожности в отношении использования, обработки и последующего уничтожения этих соединений. 20.4.13.
Реактив ОИФГ Раствор А: МаН,РО, Н,О 6,9 г МаОН, 30%-ный (вес/объем) раствор 3 мл Дистиллированная вода 45 мл Фосфат натрия растворяют в дис1вллированиой воде. Добавляя МаОН, доводят рН раствора до 7,0. Разбавляют дистиллированной водой до 50 мл н хранят при 4 'С. Реактив для испытанию о-Нитрофенил+О-галактопиранозид (ОНФГ; 51яша 0,080 г Сьеш(са1 Со ) Дистиллированная вода 15 мл Раствор А (см. выше) 5 мл ОНФГ растворяют в дистиллированной воде при 37'С. К раствору добавлшот фосфат натрия и хранят его при 4'С.
Перед использованием раствор нагревают до 37'С. 20.4.14. рН-Индикаторы для культуральных сред Список рН-индикаторов для культуральных сред приведен в табл. 20.1. зо. ОвшАя КАРАктернстикд Таблица 20.1. рн-Индикаторы длн культуральнык сред дианазои рв и окраска') Количес~во 0,0! н КаО!1, незбкаднмое для раство. рсния а,! г Обычно прн меняемая концентрация в сре. де'), г)л РК' Название 6,9(Ж) — 8,5(К) 6,1(Ж) — 7,7(С) 0,010 †,0 30 28,2 0,010 †,032 16,0 Феиоловый крас- ный Бромтимоловый синий Бромкрезоловый пурпурный Хлорфеноловый красный Бромкрезоловый зеленый 7,1 !8,5 0,0!Π— 0,032 5,4(Ж) — 7, 0(П) 5,1(Ж) — 6,7(К) 3„8(Ж) — 5,4(С) 6,2 6,0 0,015 23,6 4,7 0,020 14,3 ') Обозначения.
ж †желт, С вЂ” синяя, П вЂ” пурпурная, К вЂ” красная. ') Для добавления а культуральную среду растворяют в спирте вли готовят вадима раствор, используя а,з! н Хаон. 89 20.4.15. Суспензия гранул поли-р-гидроксибутирата (!29)1 см. также равд. 17.3.8) Источником гранул первоначально служил штамм Вас(йия теаа1епит КМ (штамм АТСС 13632), однако им могут быть и штаммы Ряеит(олтопая зрр., для которых характерно высокое содержание поли р-гидроксибутирата (ПГБ) (Ра!!егоп(, личное сообщение).
Бактериальный штамм культивируют в условиях, способствующих образованию ПГБ. Для В. )пеиа1епиит такие условия описаны Макрэ и Уилкинсоном (58), для псевдомонад — Стейниером и др. (88]. Когда уровень ПГБ становится достаточно высоким, что определяют по окрашиванию суданом черным (равд. 3.3.11), клетки собирают центрифугированием и суспендируют [в концентрации 15о!а (вес,)объем)) в ледяном 0,02 М фосфатном буфере, рН 7,2 (равд. 20.4.16). Клетки разрушают ультразвуком (равд. 5.1.2) и центрифугируют при высокой скорости. Осадок суспенднруют в щелочном гипохлоритном реактиве Уильямсона и Уилкинсона (равд. 20.
4.19) до плотности около 8 мг (сухого веса) на ! мл (98). Можно также использовать имеющийся в продаже боя)-ный гипохлорит, т. е. хлорную известь члсть ч, системАтикл 20.4.16. Калий-фосфатный буфер Готовят 0,2 М растворы 1) КхНРОА и 2) КНхРОМ Растворы смешивают в пропорциях, указанных в табл. 20.2, для получения нужного значения рН. Смесь (0,2 М фосфатный буфер) разбавляют в дальнейшем для получения нужной моляриости. См.
также равд. 6.1.2. 20.4.17. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) Основной раствор.10: !ЧаеНРОа беаиодиый, химически чистый (геаиеп! игаг!е) ХаНтРОс НтО, химически чистый (геаиеп! исайе) ЫаС!, химически чистый (геаиеп! исайе) !2,36 г !,80 г 85,00 г (РаИегопг, личное сообщение). Смесь ннкубируют с перемешиваннем прп комнатной температуре в течение 2 дней.
Суспензию оставляют для осаждения осадка и затем либо осторожно сливают и выбрасывают надосадочную жидкость, либо собирают гранулы центрифугированием. Гранулы суспендируют в воде и днализуют против водопроводной воды до удаления ионов хлора (тестируют на небольших порциях с помощью разбавленного раствора АпНОа до прекращения выпадения осадка АКС1). Затем проводят диалнз против дистиллированной воды и несколько раз промывают гранулы ацетоном с помощью центрифугированпя.
Помещают гранулы в аппарат Сокслета и экстрагируют смесью ацетона и эфира (2: 1, по объему) в течение трех дней для удаления липидов, отличных от ПГГ>. Наконец, грапулы экстрагируют горячим днэтиловым эфиром, измельчают в порошок, сушат в вакууме и определяют сухой вес гранул. После высушивания гранулы диспергируют в 0,02 М фосфатном буфере с помощью аппарата для измельчения тканей н ультразвукового генератора для получения стабильной концентрированной суспензия. Суспензию стерилнзуют автоклавированием и хранят в холодильнике. Расчет количества концентрированной суспензни, которое необходимо добавить в расплавленный агар для получения кояечной концентрации 0,25о)о (вес)объем) в верхнем слое, приведен в равд.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
