Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 12
Текст из файла (страница 12)
61 члсть !!. сР!стемхтикк Эти добавки впитываются небольшим кусочком сорбирующей ваты, заранее помещенной на дно меньшей пробирки, как показано на рис. 20.3. Добавленные химические вещества реагируют с остаточным кислородом и удаляют его, благодаря чему создаются анаэробные условия. Если не пропускать азот через пробирку Панкхурста, то для создания анаэробных условий требуется 2 — 3 ч, и в этот период для замещения удаленного кислорода следует добавить приблизительно 12 мл. молекулярного азота (11). После того как культура вырастет, через резиновую пробку вводят ацетилен до конечной концентрации 107а (по объему).
Культуру инкубиру!от в течение различных периодов времени и шприцем отбирают пробы газа по 1 мл для газохроматографического обнаружения этилена. Бактерии, нуждающиеся в микроазробных условиях для азотфиксации Полужидкие безазотные среды успешно используются для демонстрации восстановления ацетилена азот- фиксирующими спириллами (см,, например, разд. 20.3.3, где описана среда для Аноар!г!Пия!).
Полужидкие среды можно ннкубировать на воздухе, так как они обеспечивают градиент концентрации кнс.чорода, направленный от поверхности среды вниз. Зто позволяет микроаэрофильным бактериям расти при любом наиболее подходящем для них уровне содержания кислорода. Рост начинается в виде узкой полоски или тонкой пленки в нескольких миллиметрах ниже уровня поверхности среды; по мере увеличения числа клеток пленка уплотняется и приближается к поверхности среды.
Пробирку не следует встряхивать во время роста нли последующего добавления ацетилена, так как при любом повреждении пленки может открыться доступ кислорода к клеткам и инактивироваться нитрогеназа. После начала роста в пробирке или флаконе ватную пробку заменяют пенициллиновой и впрыскивают ацетилен до конечной концентрации 10са (по объему). После инкубации в течение различных периодов времени отбирают пробы газа до 1 мл для газохроматографнческого анализа (см. ниже).
62 зо. Овщхя хАРАктеРистикА Газовая хроматография 1'см. также равд. 1б.ЗА) Используют газовый хроматограф с водородным пламенным детектором. Обычно длина колонки составляет 1,5 м, внутренний диаметр 2 мм. Колонку заполняют порапаком К или М (Юа1егз Лззос)а1ез 1пс., Ргапппп)заш, Маза.). Температура термостата колонки равна +50'С, причем ее можно поддерживать при любом постоянном значении в интервале от комнатной температуры до 80' С. В качестве газа-носителя используют азот со скоростью потока - 50 смз(мин. Калибруют хроматограф имеющимся в продаже этиленом (степень чистоты 99 7о ), разбавленным азотом. Пробы газа и стандарты этилена вводят пластмассовым шприцем одноразового пользования. Поскольку на пластмассовой поверхности шприца остается небольшое количество этилена, после использования его выбрасывают и заменяют новым.
Резиновые пенициллиновые пробки также могут загрязняться этиленом, их тоже нельзя использовать повторно. На пенициллиновых пробках или резиновой прокладке доватора газового хроматографа могут оставаться отверстия от игл. Во избежание этого кончик иглы загибают, как показано на рис. 20А. В процессе хроматографирования проб газа, содержащих и ацетилен, и этилен, ацетилен выходит из ко- Рнс. 20.4. Схематическое изображение кончика иглы шприца Справа показано, как надо загнуть его, чтобы при прохождении иглы через пробки от пенициллиновых фла. конов или резиновые перегородки в них не оста. вались дырки. 63 ЧАСТЬ Ч.
СИСТЕМАТИКА лонки с порапаком позже, чем этилен, Нельзя вводить в хроматограф новые пробы, пока ацетилен от предыдущей пробы не пройдет через колонку. 20.2.8. Серология Тесты на агглютинаиию на предметных стеклах Предпочтительно использовать предметные стекла с керамическими кольцами (ободками) диаметром около 14 мм. Однако можно применять и стеклянные пластинки, разделенные на квадраты со сторонами по 2,5 см карандашом-стеклографом. Лиофилизованную антисыворотку разводят в соответствии с инструкцией фирмы- изготовителя. В одно из колец помещают каплю анти- сыворотки, а в другое — каплю физиологического раствора (0,85зй г)аС1) или нормальной сыворотки кролика. Выросшую культуру снимают петлей с поверхности агара и смешивают с каждой из капель до получения однородной клеточной суспензия без сгустков.
Суспензия должна быть мутной, но не слишком густой. Пластинку покачивают с вращением в течение 1 мин для перемешнвания клеток и жидкости, следя за тем, чтобы не расплескать суспензию, а затем проверяют ее визуально, рассматривая при ярком свете на темном фоне. Положительная реакция: клетки, взаимодействующие с анти- сывороткой, образуют комки (т.
е. суспензия выглядит гранулированной или, при сильном взаимодействии, даже «свернувшейся»). Сгустки лучше всего видны прн слегка наклонном положении стекла, когда жидкость стекает к его нижней границе. В контрольном опыте с физиологическим раствором или нормальной сывороткой слипания клеток не происходит. Если же оно всетаки наблюдается, то зто может свидетельствовать о том, что имеют дело с шероховатой формой (ц) вместо гладкой (5). Прил~ечание: смесь бактерий и антисыворотки не должна высыхать, так как иначе невозможно наблюдать какие-либо признаки агглютинации. Если смесь все же подсыхает, то опыт повторяют с большим количеством антисыворотки.
зе. ОБщАя хлРАктегистикА Предостережение: после завершения опыта пластинку погружают в контейнер с дезинфицирующим раствором (например, с 1%-ным лизолом). Руки и стол моют дезинфицирующим раствором. Это важно, так как во время смешивания клеток с антисывороткой мелкие капельки могут разбрызгаться по стеклу и попасть на поверхность стола. Антисыворотка не убивает бактерии.
Прецилитиновый тест для идентификации стрелтококков Культуру выращивают в 40 мл бульона Тодда— Хьюнтта (разд. 20.3.33) в пластмассовых (поликарбонатных илн полипропиленовых) центрифужных пробирках объемом 50 мл с завинчивающимися крышками. После инкубации при 37'С в течение 18 — 24 ч культуру центрифугируют в бакет-роторе при максимальной скорости. Надосадочную жидкость осторожно сливают в колбу Эрленмейера с дезинфицирующим раствором и протирают крышку центрифужной пробирки полотенцем, смоченным дезинфицирующим раствором.
Следует убедиться в том, что вся надосадочная жидкость слита и взмучнвания осадка во время сливания не было. К осадку добавляют 0,5 мл физиологического раствора (0,85% )чаС1) и суспендируют его, осторожно покачивая пробирку из стороны в сторону. Плотно завинчивают крышку и автоклавируют 15 мин при 121'С.
Снова центрифугируют при максимальной скорости, чтобы осадить автоклавированные клетки. Стараясь не взболтать осажденные клетки, переносят большую часть надосадочной жидкости с помощью пастеровской пипетки в маленькую пробирку. Жидкость должна быть совершенно прозрачной; если она мутная, ее снова центрифугнруют. В надосадочной жидкости содержатся растворимые антигены, экстрагированные из клеточных стенок стрептококков. К антисыворотке добавляют воду согласно инструкции фирмы-изготовителя. В полученный раствор погружают в наклонном положении капиллярную трубку (с внутренним диаметром 0,7 — 1,0 мм и длиной 75— 90 мм) так, чтобы столбик сыворотки в ней достиг высоты 2 — 3 см. Закрыв противоположный конец указа- чАсть к снсткмлтнкл тельным пальцем, капилляр извлекают из флакона с сывороткой и вытирают его внешнюю поверхность для удаления избыточной сыворотки.
Затем конец капилляра с антисывороткой погружают в экстракт антигена и, убрав указательный палец, набирают 2 — 3 см раствора антнгепа. При продвижении экстракта вверх по капилляру между столбиками антисыворотки и антигена не должен попадать воздух. Закрывают конец капилляра указазельным пальцем и капилляр вынимают. Наклоняют его почти горизонтально и, убрав палец, позволяют столбику жидкости двигаться к центральной части капилляра.
У каждого конца трубки должно остаться не меньше 1 см воздуха. Один конец капилляра погружают в глину для лепки. Стирают с поверхности капилляра отпечатки пальцев и инкубируют 10 — 15 мин. Капилляр осматривают при ярком свете на темном фоне с помошью ручной лупы. Положительная реакция: появление легкого помутнения молочного цвета в центре капилляра на стыке антисыворотки и экстракта. При дальнейшей инкубации это помутнение увеличивается и на дпе столбика жидкости выпадает осадок.
Реакция Квеллунга Бульонную культуру наносят петлей на чистое предметное стекло и оставляют для высыхания на воздухе без подогревания. (Если в таком же мазке, окрашенном кристаллическим фиолетовым, присутствует более чем !5 — 25 клеток при просмотре в микроскоп с иммерсией, культуру следует разбавить, так как при слишком высокой концентрации клеток можно получить неточный результат.) К антисыворотке добавляют воду и наносят полученный раствор петлей на покровное стекло. Одну петлю 1 % -ного водного раствора метиленового синего смешивают с антисывороткой и кладут покровное стекло каплей вниз на предметное стекло с высушенным мазком. Смотрят препарат в микроскоп с масляной иммерсией. Положительная реакция: капсулы вокруг окрашенных в синий цвет клеток становятся четко очерченными. Всегда следует проводить сравнение с контрольным препаратом, приготовленным с нормальной кроличьей сывороткой вместо антисыворотки, Если резуль- 66 ах овшля хАРлктвгистикх таты теста отрицательные, необходимо повторить осмотр через 1 ч.
Препарат предохраняют от высыхания, выдерживая его во влажной камере или герметизируя по краю покровного стекла расплавленным васпаром (смесью из равных объемов петролатума н вазелинового масла). Тест с использованием флуоресцируюи(их антител Флуоресцирующую антисыворотку («конъюгат») и флуоресцирующую нормальную сыворотку растворяют в воде.
Готовят несколько порций флуоресцирующей антисыворотки, разбавляя ее каждый раз вдвое (например, 1: 5; 1: 10; 1: 20; 1: 40; 1: 80) в фосфатном буфере с добавлением !чаС! (фосфатно-солевой буфер (ФСБ), см. равд. 20.4.17). Прн каждом разведении антисыворотки с помощью метода окрашивания,описанного ниже, а также с помощью подходящего флуоресцентного (люминесцентного) микроскопа (равд. 1.4) определяют степень флуоресценции бактериальных клеток по шкале О, 1+, 2+, 3+, 4+ (максимум).
Рабочее разведение антисыворотки составляет '/2 максимального разведения, которое дает степень флуоресценции 4+. Например, если максимальная степень флуоресценцни 4+ достигается при разведении сыворотки 1: 20, то рабочее разведение равно 1: 10, Эквивалентное разведение флуоресцнрующей нормальной сыворотки пе должно давать флуоресценции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
