Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 26
Текст из файла (страница 26)
22.8. Схема метода изучения гомологии ДНК в растворе с ис- пользоваиием гидроксилапатита и иуклеазы $1. 140 радиоактивностью, последнюю можно измерить по адсорбции на гидроксилапатнте или по устойчивости к нуклеазе 81. Общая схема этих методик представлена на рис. 22.8. Обе они предусматривают инкубацню ме- Ы ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ченой ДНК с высокой удельной активностью (в очень малом количестве) с большим избытком фрагментов не- меченой ДНК. Удельная активность должна составлять от 5 ° 104 до 2,5 ° 10' имп/мнн ° мкг, а концентрации ДНК должны быть ниже 5 мкг/мл.
Предварительные процедуры Немеченая ДНК. И для разделения на гидроксилапатите, и для реакции с нуклеазой 51 немеченую ДНК 1отовят одинаково следующим образом. 1. Исходный препарат ДНК (равд. 22.2.2) разбавляют приблизительно до 0,9 — 1,0 мг/мл. 2. Каждый препарат обрабатывают ультразвуком дважды по ЗО с (мы, например, используем ультразвуковой дезинтегратор В!озон!с П1 с датчиком на 0,375 дюймов (9,5 мм) и настройкой энергии на 60 делений). 3. Деиатурируют ДНК и гидролизуют примесь РНК, добавляя 5 н. ЫаОН до конечной концентрации 0,25 н. Нагревают до 50'С в течение 15 мин, охлаждают и нейтрализуют эквивалентным количеством НС!.
4. Проводят диализ препаратов против буферного раствора 0,02 М )Х)аС1+10-' М НЕРЕЗ, рН 7,0, и доводят концентрацию ДНК до 0,6 мг/мл. Меченая ДНК. Для реализации обеих методик требуется небольшое количество денатурированной меченой ДНК с высокой удельной радиоактивностью и большой избыток денатурированной немеченой ДНК. Удельная активность должна составлять от 0,5 10' до 2,5 1(Р имп/мин ° мкг, а концентрация ДНК«5 мкг/мл.
Титрование нунлеазьч 5А Ферментативную активность исходной нуклеазы 51 (Са!Ь!ос)1е1п-Ве)4г!пд, 1а 3о!1а, Са1Д.) определяют следующим образом. 1. Препарат фрагментированной денатурированной бактериальной 'Н-ДНК в концентрации 0,6 мкг/мл, растворенный в буферном растворе 0,02 М НаС!С!ИМ НЕРЕЗ, рН 7,0, вносят по 50 мкл в несколько полипропиленовых пробирок (12Х75 мм), содержащих по 1 мл буфера (0,05 М ацетат натрия +О,З М ЫаС1+ 0,5 мМ ЕИС1т, рН 4,6; модификация буфера А Фогта 1571).
2. Добавляют по 50 мкл двойных разведений нуклеазы $1. Для разведения используют буфер 0,02 М 141 часть т. системАтикА 10 .т 60 мкл Меченая ДНК Буферный раствор 088 М !чаС!+!О-а М НЕРЕЯ, рН 7,0 Конкурентная ДНК, 0,6 мг/мл (яли нативная ДНК лосося, 0,6 мг/мл) Общий объем 60 мкл 1!О мкл В две контрольные пробирки вносят фрагментированную нативную ДНК из спермы лосося (не имеющую гомологии с бактериальной ДНК) для измерения степени саморенатурации меченых фрагментов. Четыре пробирки используют для гомологичной реассоциации и две — для каждого из препаратов гетерологичных ДНК. Пробирки инкубируют в течение 20 — 24 ч при температуре на 25 'С ниже Т ДНК-стандарта (Т определена в буфере 33С).
После инкубации из каждой пробирки отбирают по 100 мкл препарата для определения степени реассоциации с помощью гидроксилапатита или нуклеазы 31 (см. ниже). 142 'и!аС1+ 1 мМ НЕРЕЯ, рН 7,0. Пробирки инкубируют в течение 1 ч при 50'С. 3. Добавляют 30 мкг фрагментированной нативной ДНК из спермы лосося (50 мкл при концентрации 0,6 мг/мл), осаждают ТХУ (конечная концентрация 5о/о), осадок собирают на нитроцеллюлозном фильтре и измеряют радиоактивность.
Измеряют степень гомологии, используя разведение фермента с концентрацией, в два раза превышающей концентрацию, которая необходима для полного гидро- лиза 30 мкг ДНК. Исходный препарат фермента разбавляют таким образом, чтобы его хватило для осуществления одного опыта. Исходную нуклеазу 31 титруют каждые 6 мес и хранят при — 20'С. Смесь для реассоциации. В начале эксперимента нагревают нужное количество меченой ДНК в кипящей водяной бане в течение 5 мин, а затем охлаждают льдом. Дают возможность препарату нагреться до комнатной температуры и разливают порциями по 10 мкл.
При этом температуру поддерживают постоянной, для того чтобы избежать колебания объема проб. Реакционную смесь, состав которой приведен ниже, разносят по пробиркам (6Х22 мм). М ГЕНЕТИЧРСКЛЯ ХЛРЛКТЕРИСТИКЛ Л1егодика с гидроксилапагигом Эта методика дает возможность путем избирательной адсорбции на гидроксилапатите (В1о-1(ад (.аЬога1оНез, К1с1ипопд, Са)11.) отделять двухцепочечную ДНК от одноцепочечной. Двухцепочечная ДНК адсорбируется на гидроксилапатите в 0,14 М фосфатном буфере, в то время как одноцепочечная не адсорбируется [11]. Различные партии гидроксилапатита отличаются по адсорбционной емкости, позтому иногда требуется испытать не одну партию. 1.
0,5 г гидроксилапатита вносят в пробирку (13Х Х100 мм), добавляют 3,0 мл 0,14 М фосфатного буфера (зквимолярные количества 5)аНЛРО4 и ХалНРО,), содержащего 0,4% ДСН; гидроксилапатит суспендпруют с помощью встряхивателя Ъ'ог1ех и нагревают пробирку при 60'С в водяной бане. 2, Добавляют 100 мкл реакционной смеси, перемешивают во встряхивателе Ъ'ог1ех и снова ставят в водяную баню.
3. Пробирку центрифугируют 3 — 4 мин при 5000 об/мин, сливают буфер в пробирку размером 18Х150 мм и добавляют к гидроксилапатиту еще 3 мл 0,14 М фосфатного буфера. Вновь нагревают, перемешивают, центрифугируют и сливают надосадочную жидкость в пробирку, в которой находится первый центрифугат. 4. Добавляют к гидроксилапатиту 3 мл 0,28 М фосфатного буфера, перемешивают и центрифугируют. Декантируют надосадочную жидкость во вторую пробирку. К гидроксилапатиту добавляют еще 3 мл буфера, перемешивают, центрифугируют и надосадочную жидкость сливают в ту же пробирку. 5. В каждую пробирку добавляют 30 мкг ДНК-носителя (50 мкл ДНК из спермы лосося в концентрации 0,6 мг/мл) и перемешивают, Добавляют ТХУ до конечной концентрации 5% и еще раз хорошо перемешивают с помощью встряхивателя Чог1ех.
Охлаждают в холодильнике в течение 1 ч. 6. Осадки собирают на нитроцеллюлозных фильтрах, фильтры высушивают, помещают в сцинтилляционные флаконы и измеряют радиоактивность. !43 чхсть ч, систсмАтикА 7. Сумма импульсов в двух сцинтнлляционных флаконах представляет собой общее количество импульсов в минуту в реакционном сосуде. Число импульсов в минуту в первом сцинтилляционном флаконе соответствует количеству импульсов в минуту нереассоциированной ДНК, а во втором — реассоциированной ДНК. Степень гомологии определяют, разделив значение радиоактивности, полученное при гетерологичной реассоциации, на величину радиоактивности, полученной при гомологичной реассоциации, и умножив результат на 100. В табл.
22.2 приводится пример подобных расчетов. Бреннер и др. (1!) описали эффективную методику, по которой на гидроксилапатите фракционируют ббльшие количества ДНК. Методика с нуклеазой 51 При тщательно контролируемых условиях нуклеаза Я! гидролизует одноцепочечную ДНК и оказывает слабое действие на двухцепочечную ДНК [17). Следовательно, степень комплементарности между фрагментами меченой ДНК и избытком фрагментов немеченой ДНК можно определить, измерив количество ДНК, устойчивой к нуклеазе 51 (т. е. осаждаемой ТХУ), по радиоактивности.
1. 100 мкл образца из каждой пробирки с реакционной смесью вносят в полипропиленовую пробирку (12Х Х75 мм), содержащую 1 мл буферного раствора 0,05 М ацетат натрия +О,ЗМ НаС! + 0,5 мМ ХпС!ь рН 4,6, и 50 мкл денатурированной фракционированной ДНК из спермы лосося с концентрацией 0,5 мг/мл.
Содержимое пробирки перемешивают с помощью встряхивателя Ъ'ог1ех и затем добавляют к нему 50 мкл нуклеазы 51. Смесь вновь перемешивают и инкубируют в водяной бане при 50'С в течение 1 ч. 2. Пробирки вынимают из водяной бани, добавляют равные объемы 107е-ной ТХУ, хорошо перемешивают с помощью встряхивателя Чог1ех и охлаждают в холодильнике в течение 1 ч. 3.
Осадок собирают на нитроцеллюлозном фильтре. фильтр сушат, помещают в сцинтилляционный флакон и измеряют радиоактивность. При этом выявляются только фрагменты ДНК, устойчивые к нуклеазе 51. 144 тт геннтичвскля хлрлктгристнкл Таблица 22.2. Гипотетические примеры расчетов степени гомологии ДНК (%), определенной по методу реассоцнацин в растворе с использованием гндроксилапатита п нуклеазы Б! Методика с гидроксилапатитом Неадсорби- роваиная радиоактив- ность, нмптмин Лдсорбиро. ванная ра- дноактив- ность, Степень гомологни Сосуд с реанпнонноя с ~есью 1О 900 100 90 80 !00 100 900 60 400 600 50 62 Методика с иуклеазой 51 Радиоактив ~ость ДНК.
устоичивой к и .клеазе Радиоактивнос~ь ДНК, тстоичивоа к нуклеазс 51, ичпумия Степень го. молотни, и Сосуд с рсакпнонногт спесью 51. чистые и м и Г з1 т| н 1ОО 100 62 800 500 900 600 Степень гомологии определяют, разделив число импульсов в минуту гетерологичной устойчивой к нуклеазе Б1 ДНК на число импульсов в минуту гомологичной устойчивой к нуклеазе Я1 ДНК и умножив результат на 100. Пример подобных расчетов приведен в табл. 22.2. Методика, основанная на сравнении терлростабильности Степень некомплементарности цар азотистых оснований можно определить, сравнивая термостабильность гетерологичных двухцепочечных комплексов с термостабильностью гомологичных двухцепочечных комплексов. Уменьшение количества меченой устойчивой к нуклеазе 31 ДНК определяют в процессе постепенного нагре- 145 Только фрагменты меченой ДНК Гомологичная реассоциация Гетерологичная ре- ассоциация Только фрагменты меченой ДНК Гомологичная реассоциация Гетерологнчная реассоциа- ция Лдсорбированная радиоактиваость, импгинн Лдсорбированная рв.
диоактнвность, чистые 'й члсть ч. систнмлтикл вання реассоциированной ДНК в водяной бане вплоть до температуры денатурации. Реассоциацию проводят обычным способом, используя, однако, при этом ббльшие объемы реакционных смесей. Ниже представлен состав реакционных смесей, которые готовят в пробирках размером 13Х100 мм с завинчивающимися крышками. Меченая ДНК О,!2 ма Немечсная ДНК 0,60 мл Буферный раствор 0,88 М ХаО1+10-' М НЕРЕЯ 0,60 мт Общий объем 1,32 мл 1. Пробирки инкубируют в течение 20 — 24 ч при температуре на 25 'С ниже Т меченой ДНК (определенной в буфере 55С).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
