Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Грамотрнцательные бактерии часто лизируются под действием одного лишь детергента, хотя имеется много исключений. В отличие от них почти все грамположительные бактерии приходится сначала обрабатывать лизоцимом (гидролитическим ферментом, действующим на пептидогликан клеточной стенки), а затем уже при- 22. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА менять детергент. Поэтому методы разрушения клеток для этих двух групп бактерий рассмотрены здесь отдельно. 22.1.!. Грамотрицательные бактерии Клетки из культуры, находящейся в поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазе роста, центрифугируют и ресуспендируют их в соленом буфере с ЭДТА (0,15 М ЫЕС1, 0,01 М Ыа-ЭДТА, рН 8,0) в объеме, составляющем от 1АА до '(ю объема исходной культуры.
Добавляют додецилсульфат натрия (ДСН) в виде 20%-ного (вес/объем) раствора до конечной концентрации 1272. Для ускорения лизиса колбу помещают в водяную баню при 50 — б0'С и встряхивают. О начале лизиса свидетельствует быстрое увеличение вязкости и появляющаяся опалесценция. Если бактерии плохо лизируются в этих условиях, то можно применять другие методики. Например, 1) используют более разбавленную клеточную суспензию; 2) клетки собирают в экспоненциальной фазе роста культуры, так как быстро растущие клетки более подвержены лизису; 3) добавляют лизоцим (5!пгпа СЬеписа! Со., 51.
1.оп(з, Мо.), проназу (Са!Ь1осЬегп-ВеЬ- г!пп, 1.а Юо!1а, Са!!1.) или протеиназу К (Е. М. (.аЬога1омез, 1пс., Е!Гпз1егд, Ы. У.) к суспензии клеток в солевом буфере с ЭДТА и перед добавлением ДСН инкубируют при 37'С. Во время инкубации периодически отбирают пробы для проверки на ливис под действием ДСН. В случае использования лизоцима клетки суспендируют в солевом буфере с ЭДТА, разбавленном в соотношении 1: 5, так как растворы с большой ионной силой ингибируют действие фермента.
Периодически отбираемые пробы испытывают на лизис под действием ДСН. Перед добавлением ДСН ионную силу буфера в основной клеточной суспензии восстанавливают до исходной. Для разрушения клеток грамотрицательных бактерий, которые не лизируются с помощью описанных выше методов, основанных на применении детергентов, используют один из многочисленных физических методов. Палочковидные бактерии средней длины можно разру- 1!3 ЧАСТЬ Ю СИСТЕМАТИКА шить путем пропускания суснензии клеток через пресс Френча (А|пег!Сап 1пэ(гшпеп1 Со., 5!!Чег 5рг!пдз, Мд.) под давлением 84.10' — 112 1О' Па; для разрушения более коротких палочек или кокков может потребоваться более высокое давление, а именно 21 10'— 23 10т Па.
Дополнительную информацию см. в равд. 5.1.1 и 18.1.3. Ультразвуковые дезинтеграторы обычно менее эффективны для разрушения клеток, чем пресс Френча; дополнительные сведения по ультразвуковой дезинтеграции содержатся в равд. 5.1.2 и 18.1.3.
Для микроорганизмов, которые нельзя разрушить этими методами, обычно применяют клеточный гомогенизатор фирмы Бронвилл (Вгоптч!11 511еп1!Вс Со., Косйез!сг, Н. г'.). Гомогенизатор включают на 4000 об/мин, используя равные объемы клеточной суспензии и стеклянных шариков (у Вгоптч(!! 511еп111!с Со. можно приобрести стеклянные шарики диаметром 0,1 мм, а у Со1арпо1е Ич., Еегго Согр., Заскзоп, М)зз.,— диаметром 0,074 — 0,110 мм, класс 1У, № 1420, тип С).
Дополнительная информация по этому вопросу содержится в равд. 5.1.3. 22.1.2. Грамположительные бактерии Обычно для того, чтобы сделать грамположительные бактерии чувствительными к лизису под действием ДСН, клеточные стенки расщепляют лизоцимом, который добавляют к суспензии клеток в разведенном солевом буфере (1: 5), как описано выше. Инкубационный период может составлять от нескольких минут до ясскольких часов.
Периодически отбирают пробы и проверяют клетки на ливис под действием ДСН. Перед добавлением ДСН к основной суспензии ионную силу буфера вновь увеличивают до исходного значении. Так же как в случае с грамотрицательными бактериями, лучше брать клетки в экспоненциальной фазс роста. Другие пути повышения способности грамположительных бактерий лизироваться под действием ДСН заключаются в добавлении пенициллина к активно растущим культурам илп в вырашиванпи культуры при высоких концентрациях глицина 160). Еспи размер фрагментов ДНК не имеет значения, то физическое разрушение клеток — процедура легкая и !!4 а! генетическля хлРлктеРистикл простая.
Вообще, с помощью пресса Френча грамотрицательные бактерии разрушаются легче, чем грамположительные. Наш опыт показывает, что встряхивание со стеклянными шариками (т. е. с помощью гомогенизатора фирмы Бронвилл, как было описано выше) эффективно и для тех и для других бактерий. Во всех описанных ниже методиках можно использовать фрагментированную ДНК, однако для иммобилизации на нитроцеллюлозных фильтрах (равд.
22.6.5) и для введения метки !и н11го (разд. 22.6.3) предпочтительна ДНК с большой молекулярной массой. При определении температуры тепловой дснатурации, или температуры плавления (Т ; равд. 22.5.1), все препараты ДНК, включая ДНК-стандарт, должны обрабатываться одинаковы 22.2. ВЪ|ДЕЛЕНИЕ ДНК Выделение ДНК для изучения гомологни занимает больше всего времени и вызывает наибольшие технические трудности.
Ниже описаны два метода выделения ДНК из 0,5 — 1,0 л культуры (если культура не доросла до достаточно высокой плотности, может потребоваться больший объем). 22.2.1. Метод Мармура (44] По методу Мармура, который, вероятно, является наиболее распространенным, белок из лизата удаляют хлороформом. Ниже дано краткое описание этого метода. Реактивы Солевой буфер с ЭДТА: 0,15 М ХаС1; 0,01 М ЭДТА, рН 8,0. ДСН: 20Р7л-ный (вес/объем) раствор. Перхлорат натрия: 5 М раствор, Буфер ЬВС: 0,15 М )л)аС!, 0,015 М тринатрийцитрат, рН 7,0. Примечание. Иные концентрации буфера ЬЬС обозначены в тексте следующим образом: 20Х(20-кратная концентрация) или 0,!Х(1/1О исходной концентрации).
ЧАСТЬ Ч. СИСТЕМАТИКА Рибонуклеаза (РНКаза): бычья панкреатическая РНКаза (8!рпа СЬсппса) Со„51. 1.ошз, Мо.), 1 мг/мл в 0,15 М )4аС1, рН 5,0. Раствор нагревают при 80'С в течение 10 мин для инактивации следов ДНКазы н хранят в холодильнике. Методика 1. Отцентрифугированные клетки суспендируют в 50 — 100 мл солевого буфера с ЭДТА и разрушают одним из ранее описанных методов (равд.
22.1). 2. Добавляют перхлорат натрия до конечной концентрации 1 М. 3. Добавляют 0,5 объема смеси хлороформ — нзопенганол и встряхивают 30 мин па качалке в колбе с при|ертой стеклянной пробкой. Скорость встряхивания должна быть достаточной для получения эмульсии, в то время как очень сильное встряхивание нежелательно.
4. Эмульсию центрифугируют прн 17000 д в течение 10 мни в центрифуге с охлаждением при температуре от 0 до 4'С. 5. Осторожно сливают или удаляют пипеткой верхний водный слой из каждой пробирки, стараясь не затронуть белый осадок (белок) на границе раздела фаз. Для этого 1О-мл серологическую пипетку вставляют кончиком вверх в пипетку типа Ргор(ре11е (Г1ЕЬег 5с1еп1111с Со., Р111ЕЬпгдЬ, Ра.).
Водный слой содержит ДНК и поэтому отличается высокой вязкостью. Рекомендуется, отбирая жидкость, постоянно передвигать пипетку в пробирке из стороны в сторону во избежание захвата белка с поверхности. б. Повторно экстрагируют лизат, выполняя операции 3 — 5. 7. Водную фазу помещают в химический стакан и медленно вливают туда холодный 95его-ный этанол (добавляют около двух объемов водной фазы), Осажденную ДНК собирают стеклянной палочкой, осторожно размешивая обе фазы круговыми движениями.
ДНК прилипает к палочке или наматывается на нее (рис. 22.1) . Избыток этанола удаляют, прижимая палочку с ДНК к стенке стакана; затем для удаления остатков этанола палочку на несколько минут устанавливают вертикаль- 116 М ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Рис.
22.1. Наматыванее ДНК на стсклюпою пало гку во нремя оса к и пня сс згаполом Фото Д Лрбора Рис. 22.2. Перфорированная полипропиленовая пентрифужная про. бирка объемом 50 мл для сбора осажденной ДНК. А!едкие от. воротна делают злектродрелью и обычными тонкими сверлами (размер не имеет значении). Диаметр болыпого отверстии 6 мм. Перед внесением ДНК его за~ рывают пробкой от пенипнллинового флако- на Фото Н. Крита. по, так чтобы ее конец, на котором намотана ДНК, был обращен вверх, Другим способом после добавления холодного этанола колбу встряхивают круговыми дви>кениями.
При этом образуется сгусток ДНК, который отделяют, сливая содержимое колбы в 50-мл полнпропиленовую центрифужпую пробирку, имеющую несколько отверстий на стенках !по всей окружности) и большое отверстие на дне (рис. 22.2). Перед вливанием содержимого колбы в пробирку необходимо убедиться в том, что большое отверстие закрыто пробкой. Затем осажденную ДНК промывают 1 — 2 раза буферно-эта- !!7 члсть ч системлтикл нольной смесью (1: 2) и оставляют пробирку до полного стекания этанола.
8. Стеклянную палочку с налипшей ДНК помещают в 1Π— 20 мл буфера 0,!Х 5ЬС и держат там до размягчения ДНК и удаления ее с палочки. Если пользуются вторым способом, из отверстия на дне перфорированной пробирки вгяпимают пробку, ставят пробирку в небольшой химический стакан (или в другую пробирку с объемом, слегка превышающим объем полипропиленовой пробирки) и добавляют 1О мл буфера 0„1Х ЬЗС.
Сгусток ДНК начинает растворяться и при извлечении полипропиленовой пробирки проходит через ее нижнее отверстие. Перфорированную пробирку промывают второй порцией буфера (10 мл), которую объединяют с первой. Сгусток ДНК растворяется быстрее, чем ДНК, намотанная на палочку. После полного растворения ДНК концентрацию буфера 35С доводят до 1Х, добавляя необходимое количество буфера 20Х ЗБС. 9. К препаратам ДНК добавляют РНКазу (50 мкг/мл) и инкубируют 30 мин при 37'С. 10. В раствор ДНК добавляют 5 — 10 мл смеси хлороформ — изопентанол н встряхивают 15 мии на качалке, как описано в п. 3. Эмульсию центрифугируют (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
