Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 22
Текст из файла (страница 22)
п. 4) и надосадочную жидкость сливают (см. п. 5). Экстракцию смесью хлороформа и изопентанола повторяют до тех пор, пока после центрифугирования на поверхности раздела фаз почти не останется белка. 11. ДНК осаждают этанолом, наматывая на палочку, и растворяют в буфере 0,!Х 35С. Процедуру повторяют 2 — 3 раза для удаления рибонуклеотидов. Каждый раз перед осаждением этанолом концентрацию буфера ББС доводят до 1Х.
12. Наконец, растворяют ДНК в буфере 0,1Х 55С и хранят в морозильнике при — 20'С или, добавив в пробирку 2 — 3 капли хлороформа, в холодильнике. 22.2.2. Метод адсорбции ДНК на гидроксилапатите Первыми выделили ДНК методом адсорбции на гидроксилапатите Бриттен и др. [13).
С тех пор появились описания нескольких модификаций этого метода [32, 35, 43, 47). Ниже приводится один из наиболее удачных вариантов. 118 еа ГенетическАя хАРАктеРистикА Реактивы Солевой буфер с ЭДТА (разд. 22.2.1); 20А(4-пый (вес(объем) раствор ДСН (равд. 22.2.1.); РНКаза (разд. 22.2.1); жидкий фенол, хроматографнчески чистый, насыщенный водой; гидроксилапатит; предназначенный для фракционирования ДНК биогель НТР (В!о-4хаг( ЬаЬога!ог!ез, К!СЬ4попд, СаИ.); 1,0 М фосфатный буфер, рН 6,8 (готовят, смешивая равные объемы 1 М )х)а,НРО4 и 1 М НаН,РО4); этот основной раствор используют для приготовления разбавленных растворов, как указано в тексте.
Методика 1. Отцентрифугнрованные клетки суспсндируют в 25 мл физиологического раствора + ЭДТА н добавляют 0,5 мл раствора РНКазы. 2. Добавляют 1,2 мл раствора ДСН. Колбу вращают, нагревая в водяной бане при 50 — 60'С до завершения ливиса клеток. Методика для бактерий, не разрушающихся под действием только одного детергента, описана в разд. 22.1. 3. Вязкость лизата снижают короткой обработкой ультразвуком. При этом можно добавлять проназу Ь илн протеиназу К (50 мкг(мл). Для одних микроорганизмов расщепления протеиназой не требуется, а для других оно необходимо. При добавлении протсиназы ее инкубнруют с лизатом при 50'С в течение 1 ч. 4. Добавляют 7 мл жидкого водонасыщснного фенола, встряхивают, сначала держа колбу в руке, чтобы две фазы хорошо перемешались, а затем 20 мин на качалке. 5.
Центрифугируют при !7 000 4г в пол44пропиленовой центрнфужной пробирке в охлэждаемон центрифуге при 0 — 4'С. Осторожно сливают верхний (водный) слой (разд. 22.2.1, п. 5) и вновь наливают его в колбу. 6. Повторяют пп. 4 и 5. 7. Добавляют 2,0 мл 1,0 М фосфатного буфера. Затем добавляют 2 г (удобно пользоваться чайной ложкой с измеренным объемом) сухого гидрокснлапатита. Хорошо суспендируют и осторожно встряхивают на качалке вращающего или возвратно-поступательного дей- члсть ч.
систематика стеня в течение 1 ч с такой скоростью, чтобы гидроксилапатит не оседал. 8. Суспензню переносят в 50-мл полипропнленовую центрифужную пробирку и центрифугируют 2 — 3 мин при 5000 д при комнатной температуре. Слой надосадочной жидкости (лизат) выливают в колбу (его можно использовать для повторной адсорбции ДНК), а осажденный гидроксилапатнт (на котором теперь адсорбирована ДНК) используют в п. 9. 9. К осажденному гидроксилапатиту добавляют 8мл 0,1 М фосфатного буфера.
Гидроксилапатит суспенднруют с помощью встряхивателя Чог!ех. Сразу же вливают еще 24 мл фосфатного буфера (это удобно делать с помощью автоматической пипетки). Фосфатный буфер следует вливать под давлением так, чтобы гидрокснлапатит равномерно размешивался для максимального разбавления нуклеотидов и фенола. Выжидают 1 — 2 мин, пока гидроксилапатит осядет, и центрифугируют 2— 3 мин при 5000 д, Надосадочную жидкость отбрасывают.
10. Процедуру, описаняую в п. 9, повторяют 6 — 7раз до тех пор, пока оптическая плотность надосадочной жидкости при 270 нм (максимум поглощения фенола) не станет менее 0,05. 11. Для десорбции ДНК гидроксилапатит суспендируют в 5,0 мл 0,5 М фосфатного буфера. Центрифугируют, как раньше, ио на этот раз надосадочную жидкость, содержащую ДНК, не выбрасывают.
!2. Если ббльшая часть ДНК не была удалена из лизата во время процедуры, описанной в п. 8, то после этапа 1! гидроксилапатит промывают один раз дистиллированной водой и затем добавляют его в лизат для второго цикла адсорбции. ДНК, полученную после второго цикла адсорбции, добавляют в первую порцию выделенной ДНК. !3. Препарат ДНК фильтруют через фильтр из стекловолокна (Кеече Анде! 1пс., С!1!!оп, Х, д., диаметр 2,4 см, тип 934АН) с держателем по типу шприца (бе!гпап 1пз(гшпсп1 Со., Апп ЛгЬог, М!сп.) для удаления остатков частиц гидроксилапатита.
14. Препарат ДНК диалязуют против буферного раствора 0,02 М г!аС!+1О-' М Х-2-гндроксиэтилпипера- ИО яз гйнвтичсскля ххвхктагистикл знппатрисвая соль Х'-2-этансульфоновой кислоты (НЕРЕ5), рН 7,0. Нарезают отрезки диализной трубки (Гюйег 3с!еп!!!!с Со., Р!!(зЬпгд1~) по 13 — 15 см и вымывают из нее УФ-поглощающие вещества. Для этого трубку в течение нескольких минут кипятят в 2— 5'ь,-ном растворе карбоната натрия, тщательно промывая ес водопроводной, а затем дистиллированной водой.
Трубки можно хранить в холодильнике в течение 2— 3 дней в дистиллированной воде. При более длительном хранении целлюлолитические организмы могут гидролизовать их. Конец трубки завязывают узлом, наливают в образовавшийся мешок раствор ДНК и завязывают узлом второй конец или перевязывают его бечевкой. К бечевке прикрепляют ярлык. Диализуют против 400 — 500 объемов буфера около 3 ч, меняют буфер и затем продолжают диализ в течение ночи. Препараты ДНК хранят в морозильнике илн, добавив в ннх несколько капель хлороформа, в холодильнике. Замечания Если лизат расщепляют проназой или протеиназой К, обычно достаточно одной экстракции фенолом. Важной чертой описанной выше методики является то, что в ходе операций молекулы РНК всех видов деградируют до такой степени, что не конкурируют с ДНК за адсорбционные центры на гндроксилапатите.
Для некоторых микроорганизмов, помимо панкреатической РНКазы, может потребоваться РНКаза Т!. На этапе 1 добавляют 50 — 100 ед. 5апкуо РНКазы Т1 (Са!ЫосйешВе!зг!пд, Еа Ло!1а, СаИ.), Для ряда микроорганизмов на этапе 1 РНКаза может ингибироваться. Чтобы устранить ингибирование, лизат диализуют в течение нескольких часов против физиологического раствора + ЭДТА. Помимо РНК, основной примесью в препаратах ДНК являются полнсахариды. Многие полисахариды не адсорбируются на гидроксилапатите и поэтому легко отделяются от ДНК прн добавлении к ее раствору этого сорбепта. Однако некоторые полисахарнды связываются с гндроксилапатнтом и снижают адсорбцию ДНК. Для успешного осуществления описанного выше метода иногда требуется бо,пее разбавленная клеточная ЧАГТЬ Ч. СИСТЕМАТИКА суспензия. Очевидно, разбавление влияет на завершенность ливиса и (пли) деградацию РНК.
Увеличивают объемы в 4 — 5 раз и повторяют описанные выше этапы до стадии адсорбцни на гидроксилапатите. Добавив гпдрокснлапатит к части лизата, суспензню гидроксилапатита вливают в 60-мл фильтр из огнеупорного стекла. После того как гидроксилапатит частично осядет, через фильтр пропускают весь лизат. Затем гидроксилапатит переносят в центрнфужную пробирку и завершают процедуру, как описано выше. Разработано много дополнительных модификаций ме~одов выделения ДНК; некоторые из них даны в работе (30), 22.3.
ВЫДЕЛЕНИЕ РНК Ббльшая часть нуклеиновых кислот в бактериальной клетке представлена РНК (в основном рРНК в в меньшей степени тРНК и мРНК); поэтому выделить РНК в больших количествах довольно просто. Основная проблема заключается в получении препаратов РНК, не содержащих РНКазу. Этот фермент довольно широко распространен и, кроме того, весьма устойчив к нагреванию. Оо стеклянной посуды РНКаза лучше всего удаляется прокаливанием в муфельной печи или печи для стерилизации сухим жаром.
Водные буферы и растворы обрабатывают вначале автоклавированием, а затем добавлением 0,27ь-ного диэтилпирокарбоната (221 Методы выделения РНК подробно описаны Кирби (38). Ниже приводится один из наиболее удачных вариантов метода выделения бактериальной РНК, достаточно хорошо очищенной от ДНК. Реактивы Нафталин-1,5-дисульфонат натрия, 10в/в-ный раствор (вес/объем).
Смесь фенол — крезол: 550 мл жидкого фенола, 70 мл локрезола и 0,5 г 8с идроксихииолина. Диэтилпирокарбонат (добавляют непосредственно перед лизированием клеток из-за его слабой устойчивости в воде). 22 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Буфер 55С (равд. 22.2.1). Готовят также буфер 55С, содержащий 1%-ный ДСН. ДСН, 20%-ный раствор (равд.
22.2.1). Методика 1. Клетки собирают центрифугироваиием и промывают один раз дистиллированной водой. Суспендируют пх приблизительно в 20 мл холодной дистиллированной воды и измеряют объем суспензии с помощью мерного цилиндра. 2. На каждый 1,0 мл суспензии добавляют по 0,05 мл 10272-ного нафталиндисульфоната, а также диэтилпирокарбонат до конечной концентрации 0,22/2.
После этого клетки немедленно разрушают, пропуская через пресс Френча при давлении от 7 1О' до 8,4 ° 10' Па (700— 840 кг/см2) в сосуд, содержащий 15 мл смеси фенол— крезол, 10 мл 0,5%-ного нафталиндисульфоната и 0,02 мл диэтилпирокарбоната. 3. Колбу встряхивают 20 мин на качалке. Смесь помещают в полипропнлеиовую центрифужную пробирку н центрифугируют 10 мин при 17 000 и в охлаждаемой центрифуте при 0 — 4'С. Осторожно сливают верхний (водный) слой и сохраняют его. 4.
Добавляют буфер 20 Х 55С (1 часть на 20 частей воды) и ДСН до конечной концентрации 12~2. 5. Добавляют 15 мл смеси фенол — крезол, встряхивают и центрифугнруют при 17000 д в охлаждаемой центрифуге. Водный слой сохраняют, 6. Добавляют 2 объема ледяного 95%-ного этанола, смешивают и оставляют в морозильнике иа 30 — 60 мин, Цснтрифугируют 1О мин при 4000 и в охлаждаемой центрифуге. Сливают надосадочную жидкость, дожидаясь полного стекания жидкости со стенок центрифужиой пробирки. 7. Осадок (РНК) растворяют в 30 мл буфера 55С.
Осаждеиие зтанолом, центрифугированпе п растворение повторяют до тех пор, пока надосадочная жидкость не перестанет поглощать при 270 нм. РНК хранят в буфере 55С, содержащем 1% ДСН, прп тсмпературе — 20'С пли ниже. Суммарная РНК, выделенная по описанной выше методике, обычно используется в качестве конкурента !23 ЧАСТЬ О. СИСТЕМАТИКА в экспериментах по конкуренции (разд. 22.7,3); при желании ее можно расфракцнонировать на компоненты. Препараты радиоактивной РНК обычно фракционируют (разд.
22.7.1) и компоненты используют в опытах по гибридизации. 22.4. КОНЦЕНТРАЦИЯ И СТЕПЕНЬ ЧИСТОТЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 22.4.!. УФ-спектрофотометрия Наиболее распространенный метод определения концентрации нуклеиновых кислот в растворах прн комнатной температуре состоит в измерении оптической плотности (поглощення) нрн 260 нм. При использовании кювет толщиной 1 см величину оптической плотности определяют по следующим формулам (5, 59). Для нативной (двухцепочечной) ДНК; Оптическая плотность при 260 нм мг/мл 20 Для РНК или денатурированной (одноцепочечной) ДНК: Оптическая плотность при 260 нм мг/мл 23 На практике концентрация ДНК в большинстве исходных препаратов варьирует от 0,5 до 2 мг/мл. Удобнее всего делать разведение 1: 20 (0,1 мл раствора ДНК добавляют к 1,9 мл буфера).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
