Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Затем ДНКазу инактивируют, а ДНК инкубируют с полимеразой 1 Е. сой и натриевыми солями четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (один из которых является радиоактивным, обычно с меткой 'Н). Реактивы и компоненты Буфер трио — МдС!т. 0,05 М трис+ 5 мМ МдС1ь рН 7,5. Готовят также в 10 раз более концентрированный буфер; после его разведения следует убедиться в правильности значения рН. Бычья панкреатическая ДНКаза 1 (очищенная электрофоретически; 5!язепа Сапеги!са! Со., 5!. 1.ошз, Мо.).
Ее растворяют в концентрации 1 мг/мл в 70 мМ буфере КтНРО,— КН,РОь рН 7,4, содержащем 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумпна (фракция т', 5!нша, Сйе- 135 чАсть ч. СиствмдтиКА писа! Со.) и 50% глицерина. Хранят при — 20'С. Этот же буфер используют для разведения ДНКазы до 0,1 и 0,01 мг/мл. ДНК-полимераза 1 Е. со!й Ее разводят до 200 ед/мл в том же буфере, что и ДНКазу. Хранят при — 20'С.
В нашей лаборатории успешно использовались препараты, приобретенные у фирм Ъ'ог!п1пй(оп Вюспеш1са! Согр. (атее!ю1д, 5!. 3) и МВез В(оспеппса1з (Е)айаг!, 1пб.) . Меченый тимидин-5'-трифосфат (ТТФ, тетранатриевая соль) поставляется в 50ел-нем водном этаиоле с концентрацией 0,5 — 1 мКи/мкл. Обработка ДНКазой для получения ДНК с одноцепочечньиии разрыва,чи Для этой цели предпочтительна ДНК с высокой молекулярной массой, однако можно использовать и ДНК, выделенную с помощью гидроксилапатита. Важно, чтобы опа была очень чистой.
Обработку ДНКазами осуществляют следующим образом. 1. Исходный раствор ДНК (например, в буфере 0,1 Х 55С) разбавляют до 0,2 мг/мл в буфере трис+ МдС1ь Если концентрация исходного раствора около 0,2 мг/мл, добавляют в 10 раз более концентрированный буфер. 2. Добавляют по 10 мкл ДНКазы 1 (0,01 мг/мл) на каждый ! мл раствора ДНК и инкубируют при 30'С 1 — 2 мин. 3. Инактивируют фермент, нагревая реакционный сосуд в водяной бане при 60'С в течение 10 мин. Растворы ДНК с одноцепочечными разрывами храпят при — 20'С. Методика 1. Радиоактивный нуклеозидтрифосфат наиболее устойчив при хранении в 50е/О-нем этаноле.
Для предотвращения токсического влияния этанола на полимеразную реакцию вначале в реакционный сосуд добавляют меченый ТТФ, а затем перед добавлением остальных компонентов этанол выпаривают досуха в слабом токе Ыь 22 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Таблица 22.1.
Состав смеси для проведении реакции в присутствии ДНК-полимеразы ! Коноонсот 1Π— !5 мкКи 'Н-тимидннлу трнфосфат (Нем Епя!апб )Чцс1еаг, Воз1оп, Маем выпаривают досуха перед добавле. нием остальных компонентов) ДНК с одиоцепочечиыми разрывами Трис-буфер, 0,7 М, рН 7,8 МКС1в, 0,14 М Дитиозрнтритол, 0,01 М (8(дгпа Сьепцса) Со., 81. 1.ошз, Мо.) Раствор дезоксинуклеозидтрифосфатоз, содержащий по 2 мМ каждого из следующих трифосфатов (5(ята Сйещ)сз! Со.): 2-дезоксиадеиозин-5'-трифосфат 2-дезоксипитидин-5'-трифосфат 2-дезоксигузнозин.5'-трифосфат Тимиднн-5'-трифюсфат (5!Еще Сьеппса) Со.), 0,80 мМ ДНК-полимераза ! (М11ез В1осьещ)са!з, Е)йьаг1, !пж), 200 едссмл 50 мкл 1О мкл 5 мкл 5 мкл 10 мкл 1О мкл 10 мкл 137 2.
Добавляют остальные компоненты, перечисленные в табл. 22.1. 3. Реакционную смесь (0,1 мл) ннкубируют 2 ч при 30'С. 4. Реакцию останавливают добавлением 10 мкл 1Оо/о-ного ДСН (В!о-гхас( 1.аЬога!ог!ез, гх!СЬшопб, СаИ.) и нагревают смесь в водяной бане при 60'С в течение 10 мин. 5. Реакционную смесь пропускают через колонку с полиакриламидом (биогель Р100, 100 — 200 меш; В!0-1!ад ).аЬога!ог!ез) размером 1Х7,5 см, используя буфер 0,1 Х 55С, содержащий 0,1о!з ДСН. Отбирают фракции по 0,25 — 0,28 мл (14 капель на нашем коллекторе фракций равны 0,27 мл) и добавляют по 0,5 мл буфера 0,1 Х ЗЗС, содержащего 30 мкг фрагментированной ДНК из спермы лосося на 1 мл каждой фракции. Фронтальная часть пика, соответствующая меченой ДНК, и «хвост» пика, соответствующий непрореагировавшему 'Н-ТТР, злюируются приблизительно в тридцати фракциях.
ЧАСТЬ З, СИСТЕМАТИКА 6. На полоски фильтровальной бумаги Й/па!птап /Чэ 1 (шириной 1,3 см) с интервалом 2,5 см наносят по 5 мкл каждой фракции элюата. Полоски высушивают, разрезают по отмеченным линиям, помещают во флаконы со сцинтилляционной жидкостью и измеряют радиоактивность. 7. Отбирают фракции из фронтальной части пика и пропускают раствор через пресс Френча под давлением !1,2 10' Па. Меченая ДНК должна иметь удельную активность около 2 10" имп/мин ° мкг и может быть разбавлена приблизительно до 2,6 мкг/мл в буфере 0,1 Х ;к',55С, содержащем 30 мкг/мл ДНК из спермы лосося 8.
Препарат разбавляют до активности 6000— 8000 имп/мин ° 10 мкл с помощью буферного раствора„ содержащего ДНК из спермы лосося (см. п. 5). Хранят при — 20'С. Замечания Условия, необходимые для включения метки в ДНК !и ч!!го, до некоторой степени произвольны, и успех порой зависит от случайности. Ниже дается несколько советов, которые помогут избежать некоторых наиболее часто встречающихся затруднений. Перед введением метки препарат ДНК тестируют„ используя 'Н-ТТР с низкой активностью.
Разбавляют исходный 'Н-ТТР до 20 мкКи смесью этанол — вода (1: 1, по объему) и вносят в реакционную смесь 10 мкл (0,2 мкКи) этого раствора (табл. 22.1). Готовят также контрольную пробирку с ДНК, заведомо способной включать ТТР. После инкубирования в течение 1 — 2 ч 25 мкл пробы обрабатывают 5 — 1О'/мной ТХУ, собирают осадок на мембранном фильтре, определяют радиоактивность с помошью сцинтилляционного счетчика и сравнивают с контролем. Оставшуюся часть пробы пропускают через колонку с биогелем Р100 (см. выше), собирают фракции 4 — 14 во флаконы В!о-ч!а!з (Вес(стпап !пз!Тпптеп(з, 1пс., ГИ1!ег!оп, Са!!!.) и измеряют радиоактивность в сцинтилляционном счетчике, используя подходящую сцинтилляционную жидкость для водных образцов.
Максимальная активность фронтальной части пика должна быть во фракциях 5 или 6. От 30 до 50% добавленного 'Н-ТТР должно быть включено в 1Зз 22 Генетическля хлРАктеРистикл ДНК, осаждаемую ТХУ. Меченую ДНК высокого качества элюируют при гель-фильтрации в виде острого пика с крутым фронтом. Радиоактивность во фракциях 9 — 12 составляет менее 5$ радиоактивности во фракциях 5 — 6. Она соответствует осаждающимся ТХУ коротким фрагментам ДНК, не образующим двухцепочечных комплексов. Препараты ДНКазы из различных партий и источников имеют разные активности, поэтому ДНКазу предварительно титруют, инкубируя ее 10-мкл аликвоты, имеющие различную концентрацию (например, 0,1 и 0,01 мг1мл) с 1 мл ДНК в течение различных периодов времени и определяя максимальное включение метки.
Включение 'Н-ТТФ в основном зависит от качества ДНК. Присутствие в лизатах эндогенной ДНКазы может приводить к появлению большого числа одиоцепочечных разрывов в ДНК, Если в ДНК нет разрывов, вызванных действием эндогенной ДНКазы, то без предварительной обработки ДНКазой (см. выше) включается лишь небольшое количество ТТР. Если же ДНК имеет достаточное число разрывов, то ТТР включается одинаково как после обработки ДНКазой, так и без нее. Иногда обработка ДНКазой приводит к образованию слишком большого числа разрывов, в результате чего появляются короткие фрагменты меченой ДНК (см. выше). Поэтому каждый препарат ДНК следует тестировать дважды: с обработкой и без обработки ДНКазой. Это позволяет определить количество включенного ТТР н качество меченого материала, как описано выше.
Регулируют включение ТТР путем изменения концентрации немеченого ТТР. Например, если включение 'Н-ТТР в ДНК, не обработанную ДНКазой, составляет лишь 15 — 20%, но качество его хорошее, а качество продукта из обработанной ДНКазой части того же образца низкое, то следует использовать не обработанный ДНКазой препарат и снизить концентрацию ТТР до 41,4 мМ (табл.
22.1). 22.6.4. Метод реассоциации в растворе Реассоциацию фрагментов денатурированной ДНК в растворе можно измерить оптически с помощью регистрирующего спектрофотометра. Если ДНК обладает 139 чАсть и. системлтикл проба, б которой содержится одноцепочечная меченая ДНК + большое копичестбо одноцепочечной конкурентной Д НК (немеченой1 Ннкубац ия МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГИДРОКСИЛАПАТИТА У Абсорбция дбуз цепочечнмх комплексоб Ф иентрифугиробоние Надосодочная осадок жидкость | зпюиробание дбулцепочечныкс комппексоб Днк Обдм сроаратным Добобпение дбузце- буфером почечнои ДНК-носителя Гбыдепенной из лосося) ~ добабпение дбухцепочечной ДНК— носитепя1быдепенасождение Тку ной из погася) асаждение тку измерение радиоак тибности осадка, соотбе ° дую ней НЮ изм ние радиоаксоцииРооонной днк тибйости осадка, сазтбетапбуюгц ей реассоцииробанной ДНК МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НУКАЕАЗЫ 51 Добобпение одноцепо- чечной дНК лосося и нукпвиы 31 Гидропиз нукпеазой зт одноцепочечной ДНК, дауа цена чечные комплексы ортаются негидропизааанными оахждение Днк тху измерение радиоак- тибнасти осадка, соовбепстбуюгцей реассоцииробанной ДНК Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
