Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 28
Текст из файла (страница 28)
1.он)а, Мо.) Поливинилпирролидон (Са)Ь|оспе!п-Вепс)пш 1а Юо))а, 0,02% Са))!.) Фикса 400 (Рпаппас!а Г!пе Спею!са!в, !)ррва)а, 0,02% Бмеоеп) 1. Из мембраны диаметром 15 см вырезают пробойником мембраны размером ЗХ9 мм (равд. 22.6.1). 22 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 2. Мембраны предынкубируют в течение 0,5 — 2 ч при температуре, используемой в эксперименте. В процессе инкубации мембраны несколько раз встряхивают.
3. Мембраны выкладывают на бумажное полотенце для удаления избыточной жидкости, а затем вносят их в реакционные смеси. Метод прямого связывания Рис 22.11. Флакон длн онреде- ленни радиоактианости на мем С ПОМОЩЬЮ Мстада Пря- бренных фильтрах. мого связывания количест- 1 булавка; венно определяют способ- 2 — смесь на основе толуола; ность меченой ДНК обра- З вЂ” фильтры, насаженные иа зовывать двухцепочечные комплексы с цепями ДНК, иммобилнзованной на мембранных фильтрах. Дляобеспечения значительной степени реассоциации с иммобилизованной ДНК необходимы ббльшие, чем в случае метода реассоциации в растворе, количества меченой ДНК. Поэтому обычно используют препараты ДНК с низкой удельной активностью (2000 — 10000 имп/минХ Хмкг).
Реакционные смеси содержат: Меченую ДНК (50 — 100 мкг/мл) 1О нкл Буфер 2,2ХББС 100 мкл !. Предынкубируют необходимое количество мембранных фильтров, содержащих ДНК, и хранят мембраны разных типов отдельно. 2. Готовят реакционные смеси и перемешивают их с помощью встряхивателя Ъ'ог1ех. 3. Мембраны помещают в пробирки, закрывают их пробками н инкубируют при температуре на 25'С ниже Т~ меченой ДНК (определенной в буфере 55С). Инкубация продолжается 12 — 15 ч. 4. Мембраны извлекают из пробирок и помещают в промывную камеру (рис. 22.4, В и 22.5).
Промывают 163 члсть ч. систгмлтикл дважды по 5 мин в двух объемах (300 мл) буфера 2 Х 55С при температуре инкубации. Во время промывания камеру периодически двигают взад и вперед для обеспечения протока буфера между ячейками. Мембранные фильтры вынимают и сушат на бумажном полотенце под лампой накаливания. 5. Мембраны насаживают на булавку, как показано на рнс. 22.11. 6.
Булавки с мембранами вносят в сцинтилляциониые флаконы (рис. 22.11) и измеряют радиоактивность. Поскольку мембранные фильтры с ДНК отличаются друг от друга, прямые измерения не обеспечивают высокой точности. Так же как в методике с нуклеазой 51 (' табл. 22.2), число импульсов для мембраны с гетеро- логичной ДНК делят на число импульсов для мембраны с гомологичной ДНК.
Умножив это отношение на 100, получают процент гомологии. Методика определения термостабильности 1. Проводят процедуру прямого связывания ДНК, включая промывание (п. 4). 2. Извлекагот мембранные фильтры из камеры для промывания и насаживают их на булавку ближе к головке. Булавку вкалывают в резиновую пробку (рис.
22.7), закрывающую трубку и помещают в первую пробирку для элюирования. Бели фильтров несколько, их отделяют друг от друга тефлоновыми дисками. 3, Пробирки для элюирования размером 13Х100 мм, содержащие 1,2 мл буфера 0,5 Х 55С, ставят в водяную баню и проводят постепенное элюирование двухцепочечных комплексов, увеличивая температуру бани на 5'С через каждые 10 мин. В конце каждого 10-мин периода фильтры переносят в другую пробирку для элюирования н повышают температуру на 5'С. Профиль элюирования начинают определять при температуре приблизительно на 10'С ниже температуры, при которой осуществлялось прямое связывание. Устанавливают 9 разных температур элюирования и определяют радиоактивность на фильтрах (т.
е. 10 сцинтилляционных флаконов на каждую кривую термостабильности). вп гннвтичвскяя ххгяктвгистпка 4. Сливают содержимое каждой пробирки для элюирования в сцинтилляционный флакон н промывают пробирку 0,5 мл буфера 0,5 Х 55С, сливая раствор после промывания в сцннтилляционный флакон. 5. Добавляют 10 мл сцинтилляционного раствора с тритоном Х-100 (3 части сцинтилляционного раствора толуола и 2 части сцинтнлляционного раствора с тритоном Х-100) в каждый флакон, перемешивают и измеряют радиоактивность. Интегральные кривые элюирования получают, суммируя значения радиоактивности при каждой температуре н разделив результат на общую радиоактивность (т.
е. подсчнтынают среднее значение для 10 образцов). Хотя этн кривые обратны по отношению к кривым„полученным методом реассоциации в растворе, значения Т и> могут быть определены тем же способом. Для определения профиля термостабильности с помощью автоматической пипетки заливают по 1,2 мл буфера 0,5 Х 55С одновременно во все пробирки Вассермана. Одну пробирку для элюирования ставят в водяную баню раньше других для предварительного нагревания. В дополнительную пробирку помещают термометр и отмечают точную температуру в середине и в конце каждого температурного интервала. Методика, основанная на конкурен11ии В этой методике используют фрагменты немеченой денатурированной ДНК, конкурирующие с денатурированной меченой ДНК при образовании двухцепочечных комплексов ДНК, связанных с мембранным фильтром.
Препарат- конкурент содержит 1,5 мг/мл ДНК в буфере 2,2 Х 55С; его добавляют в реакционную смесь в количестве 75 илн 150 мкг. Объемы различных реакционных смесей указаны в табл. 22.4. Данная методика сходна с процедурой прямого связывания, за исключением того, что во всех реакционных пробах используется один н тот же вид фильтра с ДНК, а вид и количество конкурентной ДНК различны. Для каждого объема конкурентной ДНК используют две пробирки и ставят б проб без конкурентной ДНК в нулевой точке.
Для определения процента гомологии величину подавления связывания за счет фрагментов гетерологич- 155 ЧАСТЬ Щ СИСТЕМАТИКА Таблица 22.4. Состав реакционных смесей для определения конкуренция при изучении гомологни ДНК мембранным методом Коля»ест»о конкурентное ДНЬ: Добевляемма компонент 75 мкг !50 мнг 10 мкл !О мкл 50 мкл 10 мкл 100 мкл Меченая ДНК (50 — 100 мкгггмл) Конкурентная ДНК в буфере 2,2Х Х55С Буфер 2,2Х58С Общий объем 100 мкл !10 мкл 50 мкл 110 мкл !10 мкл Таблица 22.5. Гипотетический пример расчетов процентов гомологии ДНК в процедуре определения конкуренции прн использованнн мембранного метода Поде»пенн- ене.
вм»7мн» Имп7 мни Го»аког»я, Прямое связывание без конкурента Гомологичный конкурент (75 мкг) Гомологичный конкурент ('150 мкг) Гетерологичный конкурент (75 мкг) Гетерологичный конкурент (150 мкг) 1000 120 880 100 90 9!О 100 600 (600/880) !00 = 68 620 (620/910).100 = 68 400 380 22.7. ГОМОЛОГИЯ РНК Методика определения гомологни рРНК отличается от методик определения гомологии ДНК, так как с РНК комплементарно взаимодействует только небольшая фракция (0,1 — 0,3огго) всей ДНК.
Поскольку РНК комплементарна лишь одной из цепей ДНК, молекулы РНК не связываются комплементарно друг с другом. Главным требованием при проведении опытов с РНК являет- 156 ной немеченой ДНК делят на величину подавления за счет фрагментов гомологичной немеченой ДНК прн каждой концентрации конкурента и результат умножают на 100. Пример подобных расчетов приведен втабл.22.5. 22. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ся отсутствие РНКазы на фильтрах и стеклянной посуде.
В данном разделе описаны методики прямого измерения связывания меченой РНК с ДНК, иммобилизованной на мембранных фильтрах, или непрямого определения конкуренции при связывании. Дополнительная информация по методикам и интерпретации результатов содержится в работах [9 — 11, 20, 26, 28, 29, 36] 22.7.1. Предварительные процедуры Как и прн определении гомологии ДНК мембранным методом, перед использованием аналогичного метода для РНК проводят ряд подготовительных процедур. Очистка стеклянной посуды и буферов от РНКазьс (22] Всю стеклянную посуду прокаливают в муфельной печи или в печи для стерилизации сухим жаром.
Пластмассовую посуду автоклавируют, погружая ее в 0,1вй-ный детергент (например, изоклин, 1зо!аЬЕ Со., Айгоп, О)4!о), Все буферы автоклавируют н обрабатывают 0,2%-ным диэтилпирокарбонатом (3!ища С!4еписа! Со., 31. 1.ошз, Мо.). Приготовление меченой РНК Методика введения метки в рРНК очень похожа на аналогичную процедуру для ДНК (равд. 22.6.2). В качестве предшественников при включении метки в РНК !и ч!Ео используют обычно '4С- или 'Н-урацил или уридин илн Н222Р04.
В течение последних 30 мин инкубационного периода часто создают большой (100-кратный) избыток немеченого предшественника для снижения удельной активности мРНК. Меченую РНК выделяют так же, как немеченую (равд. 22.3). В молекулы РНК можно также ввести !и ч!!Го '2'1 (равд. 22.6.3). Фракционирование РНК Поскольку существует несколько классов РНК, меченую (ые) РНК, предназначенную для экспериментов по гибридизации, обычно отделяют от остальных. Хотя ЧАСТЬ Ю СИСТЕМАТИКА можно выделить рнбосомы, разделить их на субчастицы и затем выделить из них рРНК, обычно фракционируют суммарную РНК и разделяют РНК разных типов методом электрофореза в полиакриламидном геле 18, 24, 40, 531 или центрнфугированием в градиенте сахаровы [461. 23Я-рРНК фракционируют центрифугированием в градиенте сахаровы 5 — 20%, приготовленном в буфере 1 Х ЯЯС. Фракционирование 168-рРНК может осложняться за счет соосаждения продуктов деградации 23 Я-рРНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
