Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Конкурентная РНК Исходные препараты РНК разбавляют до концентрации 1 мг/мл буфером 0,1 Х ЯЯС + 10 ' М НЕРЕЯ, рН 7,0. Пробы нагревают в течение 5 мин в кипящей водяной бане, быстро охлаждают во льду и хранят при — 80'С. Нммобилизация ДНК и предынкубация мембран, содержащих ДНК ДНК иммобилизуют на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах, как описано в равд. 22.6.5 «Предварительные процедурыь.
Используют автоклавирование и обработку буферов диэтилпирокарбонатом; если препараты ДНК содержат примеси РНКазы, то их обрабатывают перед денатурацией диэтилпирокарбонатом или протеолитическими ферментами. Продолговатые фильтры размером ЗХ9 мм или круглые с диаметром 10 мм предынкубируют в смеси Денхардта. Используют буферы, не содержащие РНКазу. Недавно были нммобнлнзованы фрагменты или молекулы ДНК и РНК путем нх ковалентного присоеди. пения к дназобензилоксиметилированной бумаге 17, 551.
Иммобилнзованная таким способом ДНК может быть очень полезна в экспериментах, основанных на сравнении термостабильностп. Эту бумагу можно приобрести у двух фирм (ЕпеоЬопб, Епхо В1оспеппса!з, 1пс., ашетт т'огК Н. У., ЯСЫе1с1тег апб Яс1ше! Со., Кеепе, Н. Н.). Инструкции по использованию бумаги высылаются обеими фирмами. 22 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТНКА Применение формамида Формамид является лучшим растворителем для снижения температур денатурации двухцепочечных комплексов ДНК и гибридов РНК вЂ” ДНК. При более низких температурах денатурации снижается степень термической деградации нуклеиновых кислот. В буферах, содержащих от 0,035 до 0,88 М ЫаС!, на каждый процент формамида Т ДНК снижается на 0,60'С (34].
Для гибридизации рРНК на фильтре Джиллеспи и Джиллеспи [29) применяли 50%-ный формамид в буфере 6 Х ЯЯС при температуре инкубации 38'С, а Де Лей и Де Смедт (20) использовали 20%-ный формамид в буфере 2 Х ЯЯС и прн температуре инкубации 50'С. Для экспериментов по гибридизации с использованием 20%-ного формамида готовят буфер 5,5ХЯЯС+ +10-' М НЕРЕЯ (табл. 22.6), содержащий 55% форма- мида, а также буфер 3,5ХЯЯС+10-2 М НЕРЕЯ (табл.
22.6), содержащий 35% формамида. Для опытов с использованием 50%-ного формамида готовят буфер 3,5ХЯЯС+10-2 М НЕРЕЯ, содержащий 87,5% форма- мида. 22.7.2. Мембранный метод Методика прямого связывания Поскольку лишь небольшая часть ДНК комплементарна РНК, в зависимости от удельной активности препарата рРНК для эксперимента могут потребоваться ДНК-содержащие мембраны разного диаметра (например. до 10 мм).
1. Прямое связывание РНК с использованием небольших продолговатых мембран ЗХ9 мм проводят согласно методике для прямого связывания ДНК. В одну гробирку вносят 0,5 мкл меченой РНК. Мембраны отмывают так же, как в случае с ДНК. Для отделения неспаренных фрагментов рРНК от гибридов камерудля промывания помещают в раствор панкреатической РНКазы (25 мкг/мл в буфере 2 Х ЯЯС) и инкубируют 30 мнн при 37'С.
После инкубации мембраны еще раз промывают. Измерив радиоактивность на мембране, определяют количество содержащейся на ней ДНК ЧАСТЬ Щ СИСТВМАТИКЛ Таблица 22.6. Состав реакционных смесей для онределення конкуренции нри изучении гомологни РНК мембранным методом Колнеество конкурентной РНК арн размере фа сыра Зкй мм Добаалвел~мй компонент 20 мкг ~ йй мнг 20 мкл 20 мкл 2э а'кл 50 мкл 25 мкл 40 мкв ) 40 мкл 20 лткл 50 мкл 40 мкл !!О мкл Меченая РРНК (25 мкг/мл) Конкурентная рРНК (1 мг/мл) Буфер 0,1Х55С+!О-а М НЕРЕ5 Буфер 55Х55С+10-а М НЕРЕ5 Буфер 35Х55С+10 а М НЕРЕ5 Общий объем !!О мкл ~ 1!О мкл Продолжение Коли ест конку рентьой РНК нрн диаметре фнлыров !О мм Добавлнеммй комоонент 00 мнг $00 мкг 50 мкл 50 мкл 50 мкл 200 мкл 350 мкл Меченая РРНК (25 мкг(мл) Конкурентная рРНК (1 мг(мл) Буфер 0,1Х55С+10-' М НЕРЕ5 Буфер 5,5Х55С+10-' М НЕРЕ5 Буфер 3,5Х55С+10-' М НЕРЕ5 Общий объем 50 мкл 100 мкл 200 мкл 350 мкл 50 мкл 100 мкл 200 мкл 350 мкл Методика, основанная на конкуренции Используют различные реакционные смеси в зависимости от размера мембран (табл.
22.6). Дополнительные сведения по атому вопросу содержатся в работе [36). Пробирки с реакционной смесью иикубпруют в тече- 160 (равд. 22.4.3). Если известна удельная активность РНК, то в импульсах в минуту или в микрограммах определяют связанную РНК, приходящуюся на 1 мкг ДНК. 2. Фильтры диаметром 10 мм делают с помощью дырокола для бумаги с одним отверстием, убедившись, что он хорошо очищен от смазочного масла.
Инкубируют в 4-мл пробирках (Жеа(оп 3с)епНДс, М(1)ч!Пе, )т). Я.) в реакционной смеси объемом 0,36 мл. В каждую пробирку вносят 1 — 2 мкг меченой рРНК. 3. Термостабильность гибридов определяют так же, как и в случае с двухцепочечными комплексами ДНК (равд. 22.6,6). 22. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ние ночи при бб'С, после чего мембраны отм!явают так же, как в методике прямого связывания. Можнсь обрабатывать мембраны РНКвзой, хотя зто почти не влияет на Результат. Затем определяют количество ДНК на мембранах.
Расчеты проводят так же, как в экспериментах по изучению гомологии ДНК с той разницей, что результат выражают в имп/мин мкг ДНК, связанной с мембраной. 22.8. ЛИТЕРАТУРА 22.8Д. Общая литература 1. Вмпеп )7. Е, Ссадит В. Е., Луеи(е!й В. )7. Апа1уяы о1 гереаппк ОНА зейцепсея Ьу геаязос1аПоп, Ме)ьойя Епхушо!., 24 Е, 363— 406 (1974). Несмотря на то что эта работа касается в основном ДНК зукариог с повторяющимися последовательностями, она содержит много практической информации, которую можно использовать при работе с ДНК бактерий (прокариот).
2. Келлен Р. Е. Рг!пс!р1ея апй ргаспсез о1 пцс1е!с асЫ Ьуьг!й(ха- 1!оп, Ргои. Нпс!е(с Ас!й Цез. Мо!, В1о1., 11, 259 — 301 (1971). Обзорная статья, посвищенная гибридизации различных видов РНК с помощью мембранных методов. 3. МсСагыу В. А, Сйигсй )7. В. ТЬе ереси)с!1у о! то)еси!аг ЬуЬПйм канон геас1юпя, Аппп. Неч. Вюсьеш., 39, 131 — 150 (1970). Статья помогает понять принципы реакций гибридизации ДНК н РНК (гомологии).
4. Мооге )г. Д Нцс1е!с асЫ геаззос!абоп аа а Еп!йе 1о Еепепс ге1а1ейпеяя агпопк Ьас1епа, Сцгг. Тор. М!сгомо!. 1пппцпо!., 64, 105— 128 (!974). Обзорная статья по использованию сходства нуклеиновых кислот н таксономии бактерий. 5. Репей Х. Н. Рппс1р1ся апй ргаснсе о1 ехрепшепм чч!!Ь ппс1ме асЫз, Лойп 1ч11еу апй Боля, 1пс., Нечг Уогй, !972. Книга содержит общую н специальную информацию, хасающуюся широкого круга экспериментов. б.
Фе!тиг Л С. НуЬпгизаиоп апй гепа1цгаг~оп рине!!ся о1 пцс!е!с асыя, Аппп. )(еч. В)орьуя. В!оепк., 5, 337 — 361 (1976), Обзор посвящен в основном кинегике реассоциацин в свободном растворе. 22.8.2. Специальная литература 7. А!юте А С., Кетр Р. Х., В!ага О. )7. Ргос. Нан. Асей. 5с1. О.5 А. 74, 5350 — 5354 (1977). 8. Вгяйор В. Н. Д, Супубгоой А )7., Вргебе!тип В. Л. Мо!. В!о1., 26, 373 — 387 (!967). 161 ЕЕ. ГЕИЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 43.
Магйоо О. О.,!палое 1. О. Апа!. В!осЬегп., 59, 555 — 563 (!974). 44. Магтш 1. Л. Мо!. В!о1., 3, 208 — 2! 8 (1961). 45. Магтиг 7., Росц Р. 3. Мо1. Вю)., 5, 109 — 118 (1962). 46, МсСоийеу Е. Н. Ме!Ьобе Впеуво1., 12А, 620 — 634 (!967). 47, Меюйе )Р. О., Оо!а!его О. У., На!1 М. )г. Апа1. Вюсбею, 58, 82 — 88 (1974). 48. Ноиоцата М., Рабаио 7. 5. Ыа!пгс (Ьопбоп), 242, 44 — 47 (!973), 49.
Огоее 1. М., УУе!тиг 7. О. В!осбею!е!гу, 13, 5467 — 5473 (!974). 50, )(!ейу Р. 97. 7., О!есйтаил ЗГ., )гйойее С„Вегб Р. 3. Мо1. В1о!., 113, 237 — 25! (1977). 51. БеЫ!ег Д. А, Малс(е! М., 3. Вас!ег)о1., !06, 608 — 614 (!971). 52. Бйароийл!йоо Х. О, пегое У. Р., гса!оо!!ей! Е. Л, )оаиоо 5.,0, ВоЬгоо У.
У. Апа1. В)осЬсгп., 75, 234 — 240 (1976). 53. Зое)л М. А., Егоеее С. )г., Расе В„Расе Н. Р, Л. Мо!. Ечо!., 2, 167 — 174 (1973). 54. Зт!!й М. 7, Вг!!!ел )г, У., РаоЫеои Е, Н. Ргос, 5)а!1. Асаб. боб О.З.А., 72. 4805 — 4809 (1975). 55, Яагй О. гг., Зг!!!ате У. О. (4ос)е!с Ас!Зь Вез., 6, !95 — 203 (1979). 56. ТегеЬа А., МсСаг!Ау д. Х. Б!оспепнв!гу, 12, 4675 — 4679 (1973).
57. Уод! У. М. Еог. Л В)осЬев, ЗЗ, !92 — 200 (1973). 58. Мулла 5. У., Назйацеи Х. М. Л. Мо!. В!о1., 8, 333 — 340 (1964). 59. Руе!таг У. О, ОаеМеои Ф. Л. Мо!. В!о!., 31, 349 — 370 (1968). 60, Уатайа К,, КотаЗага К. д. Оеп. Лрр(. М!сгоб!о), 16, 215 — 224 (1970). Часть И ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В ЛАБОРАТОРИИ ВВЕДЕНИЕ Г. Филлипс Полное уничтожение бактерий путем стерилизации, меры по предотвращению заражения и дезинфекция представляют собой важные стороны лабораторной работы. Методы общей бактериологии, опирающиеся на морфологию, рост, генетику, обмен веществ и систематику бактерий, основаны на использовании чистых культур, поддержание которых зависит от предшествующей стерилизации и последующего предотвращения заражения другими бактериями, содержащимися в средах, емкостях и на инструментах.
Кроме того, бактериологические методы основаны на ликвидации оставшихся бактерий, которые могут инфицировать другие культуры и, что еще важнее, людей. Двойная цель техники лабораторной безопасности заключается в защите как эксперимента, так и экспериментатора, но безопасность человека стоит, конечно, на первом месте. Из того факта, что обычно используемые бактерии присутствуют в окружающей среде, как будто следует, что онн безвредны для человека. Действительно, между непатогенностью и патогенностью нет резкой границы; фактически бактерии имеют широкий спектр степени вирулентности по отношению к человеку.
Вчерашний сапрофит сегодня может стать паразитом, а завтра возбудителем заболевания (в качестве примеров можно назвать Еясйег1сй1а со11, Рго1еия пи1йаг1я, Ряеиг1отопав аегип1пояа, Багга!!а тагсеясепя и Вас!1!ия сегеия). Никогда нельзя забывать, что со всеми бактериями следует работать как с потенциальным источником опасности для здоровья человека. В первой главе этого раздела описываются методы стерилизации материалов паром (влажным жаром), 164 введение сухим жаром, газами, облучением и фильтрацией. Вто рая глава содержит методы физического предотвращения заражения и химической дезинфекции как в общих целях, так и для специальных лабораторных операций. В настоящем руководстве при описании методов, в которых экспериментатор может подвергнуться опасным химическим или биологическим воздействиям, приведены соответствующие предупреждения.
Правила радиоактивной безопасности представлены в равд. 16.4.1. Глава 23 СТЕРИЛИЗАЦИЯ М. Коржинский Цель процесса стерилизации состоит в удалении илн уничтожении всех живых микроорганизмов внутри илн на поверхности предмета. В микробиологических лабораториях для стерилизации культуральных сред, оборудования и стеклянной посуды используется пар, для стерилизации стеклянной посуды и металлического оборудования — сухой жар, для стерилизации инструментов — газ, для стерилизации растворов — фильтрация и в особых случаях применяют радиоактивное облучение. Стерилизация широко используется в больницах, фармакологии и на производстве.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
