Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 27
Текст из файла (страница 27)
2. Пробирки охлаждают до комнатной температуры и добавляют 1,32 мл 50о1о-ного (по объему) раствора формамида в дистиллированной воде. 3. Пробирки помещают в циркулирующую водяную баню, уровень воды в которой должен быть чуть ниже крышек пробирок во избежание изменения концентрации компонентов в пробирках за счет испарения и конденсации жидкости на стенках пробирок.
4. Определение термостабильности начинают при 45'С и выдерживают пробирки при этой температуре в течение 5 мин. Затем отбирают пробу 200 мкл, вносят ес в пробирку, содержащую 1,0 мл буферного раствора ацетат+ КаС1+ ЕпС!т, рН 4,5 (см. выше методику с гидроксилапатптом), и вновь помещают пробирку с реакционной смесью в водяную баню. Отбирают пробу стандартной пипеткой или микропипеткой с положительным вытеснением (другие микропипетки не обеспечивают точных результатов из-за колебаний температуры). 5. Температуру водяной бани повышают на 5'С и в течение 5 мин ждут, пока она установится. Еще через 5 мин отбирают следующую пробу.
Продолжают таким образом до 90'С вЂ” всего отбирают 10 проб. В пробы вносят нуклеазу 51 (см. методику с нуклеазой $1). Число импульсов в минуту устойчивой и нуклеазе 51 ДНК откладывают против температуры. Температуру, при которой 50о1о двухцепочечных комплексов становятся чувствительными к нуклеазе 51 146 М. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА (т. е. диссоциируют), обозначают Т и~ (необратимое разделение цепей, индекс 1 от англ. 1Ггечегз(Ые — необратимый). Разницу между Т и для гомологичных и гетерологичных цепей обозначают ЛТ иь Количество ошибочно связанных пар азотистых оснований, приходящихся на каждый градус Цельсия ЛТ иь варьирует от 1 до 2,2о/о. Определение значений Со/ Начальная реассоциация цепей ДНК в растворе происходит по типу кинетики второго порядка 11, 6, 12, 19, 59].
Скорость реассоциацин является функцией величины генома„ ее используют для определения его размера. Обычно уравнение реакции 2-го порядка !уравнение (1)] можно преобразовать ]уравнение (2)] для получения так называемых кривых Со/ !12]. 1/С вЂ” 1/С,= ей С/С„= 1/(1+ йс,/), где С вЂ” концентрация одноцепочечной ДНК в момент времени 1 в молях нуклеотидов на 1 л; Со — концентрация одноцепочечной ДНК в нулевой момент времени в молях нуклеотидов иа 1 л; / — время в секундах, а /о— константа скорости реассоциации.
Количество молей нуклеотидов на 1 л равно частному от деления количества ДНК в мг/мл на 331 мг ДНК иа ммоль нуклеотидов. Единица ммоль/мл равна моль/л (М). Уравнение (2) соответствует гиперболической кривой, описываемой общей формулой у= 1 (1+ах).
(3) Если в уравнении (3) у= Чв то х=1/а=х4/,, а а=1/х/, При откладывании на графике логарифмов значений х ири у=ЧА получаем !да=1п1/х /,—— — 1дх /,. В общем виде логарифмическая кривая для 1д С,/ представлена на рпс. 22.9. Участок кривой, соответствующий изменению абсциссы приблизительно на два логарифма, является почти линейным. Это объясняется тем, что любое существенное изменение величины С/Со происходит в интервале от 1/(!+О,1) до 1/(1+10), т. е. при значении 147 часть и.
систгмлтикА 00 -ч ч тз чо а~05 ч О а 0 0 00 7,0 10,0 с,сш о 0~1 8 Рис. 22.9. Обобщенная кривая Сзк При значениях Си~а значения 1/(1+Си) равны или превышают 0,9. Если СМ>Ь, значения 1/(1+ +с 11со,1. /зСо1, варьирующем от 0,1 до 10. Константа скорости /1=-1/Со/х1„а ее размерность моль-' 2-'. Денатурированная ДНК в растворе может реассопиировать при значениях йСо1 намного выше 1О, поэтому значение точного времени инкубации или точных концентраций фрагментов ДНК определять не обязательно. Однако при определении значений Со1тн эти параметры необходимы, так как в этом случае определяют ряд точек между АСо/=0,1 и 9Сег=!0. На практике значения Со/ для бактериальных ДНК варьируют приблизительно от 0,1 до 50.
Изменяя время инкубацин и концентрацию немеченой ДНК или и то и другое вместе, можно получить отдельные значения Св1. В табл. 22.3 приведены значения Со1 для четырех различных концентраций ДНК и восьми различных времен инкубации. Набор смесей для реассоциации готовят обычным способом 1разд. 22.6.4 «Предварительные процедуры»)' по две пробирки для каждой концентрации ДНК и каждой температуры.
После завершения инкубации одной серии смесей пробирки помещают в морозильник до окончания инкубации всех остальных серий. Степень образования двухцепочечных комплексов определяют с помощью гидроксилапатита или нуклеазы 51 (равд. 22.6,4). 148 Таблица 22.3. Значении Са! кли различных концентраций ДИК и времен реассоциации Немеченая ДНК Время вквнваленг, моль!л аквнваленг, мгкГмл мкг/НО мкл са т 1,8 1Оа 0,27 10-4 1,37 10 4 5,49 10 4 8.24 10 4 9,1 45 182 272 3,6 104 7,2 104 ! 44 104 2,88.104 5 76.104 7,20 104 8,64 104 Долю фрагментов ДНК, несорбирующихся гидроксилапатитом или чувствительных к нуклеазе $1, откладывают по оси у, а значения Со! — по оси х в логарифмическом масштабе. Если количество двухцепочечных комплексов измеряют с помощью гидроксилапатита, то константу скорости и вычисляют по уравнению (2).
Однако результаты, полученные по методике с нуклеазой 51, не отражают кинетику 2-го порядка, поскольку при этом гидролизуются концы двухцепочечных фрагментов. Отношение между этими двумя процедурами можно 1 5 20 30 1 5 20 30 ! 5 20 ЗО 1 5 20 30 20 30 20 30 20 30 20 ЗО Лт ГЕНЕТИг!ЕСКЛЯ ХЛРАКТЕРИСТПКА 0,5 0,5 0,5 0,5 1,0 1,0 1,0 1,О 2,0 2,0 2,0 2,0 4,0 4,0 4,0 4,0 8 0 8,0 16 16 20 20 24 24 0,049 0„247 0,99 1,48 0,097 0,49 1,98 2,97 0„194 0,986 5,93 0,388 1,97 7,90 11,9 !5,8 23,7 31,6 47,5 39,5 59,3 47,4 71,2 ЧАСТЬ Ъ.
СНСТЕЫАТНКЛ представить следующим образом: — =- [1/(1 —;йС,()]~ ", (4) где 5 — концентрация ДНК, чувствительной к нуклеазе 51 [54]. Уравнение (4) можно преобразовать: [З/С,) -'*= ! /(1+йС,/). (5) Если на графике откладывают результаты, полученные с применением нуклеазы 51 по уравнению (5), то получают кривую Сот, сравнимую с кривой, получаемой при использовании гидроксилапатита. Важно также помнить, что на скорость реассоциации сильно влияет ионная сила, поэтому сравнивать результаты можно лишь при одинаковой ионной силе растворов.
Дополнительная информация, касающаяся кинетики реассоциации и кривых Се(, содержится в работах [1, 12, 19, 51, 59). 22.6.5. Мембранные методы Мембранный метод определения гомологии ДНК отличается от метода реассоциации в растворе тем, что немеченая ДНК иммобилизуется на нитроцеллюлозном фильтре.
Общая схема этого метода приведена на рис. 22.10. Предварительные процедуры Иммобилизацию ДНК на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах и приготовление конкурентной ДНК можно провести за несколько месяцев до эксперимента, а то время как предыикубация мембраны является частью самого эксперимента. Приготовление конкурентной ДНК 1. Препарат ДНК (2 мг/мл в буфере 0,1 Х 55С или 0,02 М ХаС! + 1Π— ' М НЕРЕ5, рН 7,0) дважды пропускают через пресс Френча (11,2 10' Па) или обрабатывают ультразвуком (равд.
22.6.4 «Предварительные процедуры»). 150 Си ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИК Т МЕТОД РРЯМОГО СВЯЗЫВАНИЯ МЕТОД, ОСНОВАННЫЙ НА КОНКУРЕНОИИ Проба, содержащая одночепочеч- проба, содержащая одночепочочную меченую ЛНК ную меченую дНК большое количгсгпбо одноиепочечнай конкурентной лАНК сбязс бонне с мембранным филопром, содержащим одноиепочечную лТНК 1немеченую) удаи я Оспмыбко мембранного филсгпра 1дбуячепочечные комплексмлАнк осюаююся обязанными с ним) до~сушибоние мембранного филыпра и измерение радиоакюибноппи Рис.
22ЛО. Схема методов изучения гомологии ДНК с цомогцыо прямого связывания и конкуренции. 2. ДНК денатурируют нагреванием в кипящей бане. в течение 5 мин, после чего раствор ДНК быстро охлаждают, помещая пробирку в лед. 3. Денатурированную ДНК диализуют до равновесного состояния против охлажденного буфера 2,2 Х 55С. 4. Доводят концентрацию ДНК до 1,5 мг1мл, добавляя буфер 2,2 Х 55С. Если препараты ДНК имеют значительные примеси РНК или отличаются высоким мол. процентом (Ст+С), их денатурируют с помощью )х)аОН (равд. 22.6.4 «Предварительные процедуры») .
Иммобилизации ДИК на мембране. Ниже приводится методика Джиллеспи и Спигелмана (28), адаптированная применительно к нитроцеллюлозному мембранному фильтру ВА 85 диаметром 15 см (5СЫе1с)тег апг) 5СМ- е11 Со., Кеепе, )КТ. Н.) с рабочей фильтрующей поверхностью около 173 смз. При иммобилизации 4,35 мг ДНК на каждый квадратный сантиметр приходится 25 мкг ДНК. Если размер мембраны меньше, соответственно изменяют количества ДНК и буфера.
151 часть ч. систвматик. 1. 4,35 мг ДНК разбавляют буфером 0,1 Х 85С (=90 мл) до концентрации 50 мкг/мл. 2. ДНК денатурируют, нагревая раствор (в 125-мл колбе Эрленмейера) в кипящей бане в течение 10 мин, затем быстро охлаждают его, вливая в 800 мл буфера 6 Х 55С, охлажденного во льду (для получения концентрации ДНК около 5 мкг/мл). 3. Нитроцеллюлозный фильтр диаметром 15 см медленно кладут на поверхность дистиллированной воды таким образом, чтобы его поры заполнились водой (если мембрану погрузить сразу, образуются воздушные пузыри, которые препятствуют равномерной фильтрации).
4. Мокрый мембранный фильтр кладут на держатель (равд. 22.6.1) и промывают мембрану 500 мл холодного буфера 6 Х 55С при скоросги потока -30 мл/мин. Затем денатурированную ДНК пропускают через фильтр и снова промывают 500 мл буфера 6 Х 55С. 5. Мембрану высушивают при комнатной температу:ре, а затем в течение ночи при 60 'С. 6. На краю мембраны делают пометку карандашом, разрезают фильтр на 2 половины, отделяют одну от другой половиной кусочка бумаги, которой мембраны были переложены в упаковочной коробке, и помещают их в конверт.
Хранят в зксикаторе над Са504 при комнатной температуре. Мембраны берут за внешний край, избегая касания к той поверхности, на которой находится ДНК. Из большого мембранного фильтра выреза!от маленькие диски в основном на центральных участках. Лредыннуба!(ия мембран, еодержаи(ик ДНК Смесь Денхардта для предынкубации (21] содержит следу!ощие компоненты, растворенные в буфере 2 Х 55С: Бычий сывороточный альбумин (Фракция Ч, Б)К!па 0,02% Спеппса! Со., 3!.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
