Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 23
Текст из файла (страница 23)
При этом величина поглощения не превышает пределов измерения большинства спектрофотометров и ес определяют прямо в миллнграммах ДНК на 1 мл исходного препарата. Метод УФ-спектрофотомстрнн используют также для обнаружения примесей. 1) Белки сильно поглощают свет при 280 нм. Показателем загрязнения исследуемого раствора белком служит отношение величины оптической плотности раствора нукленновой кислоты при 260 нм к ее величине прн 280 нм (Асан/Ало). Однако коэффициент экстинкцип белка очень низок по сравнению с коэффициентом экстннкцни нуклеиновых кислот, и, следовательно, отношение Авм/Атно нельзя считать 124 22 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА очень чувствительным показателем присутствия примесей.
2) Спектр поглощения нуклеиновых кислот имеет максимумы приблизительно при 208 н 260 нм, а минимум — при 234 нм. Ппк при 208 нм не специфичен для нуклеиновых кислот, так как при этой длине волны поглощают свет многие соединения. Если в препарате нукленновой кислоты содержится примесь, поглощающая при 208 нм, то оптическая плотность в минимуме спектра нуклеиновой кислоты будет завышена. Таким образом, отношение Азм/Аыэ — довольно чувствительный показатель присутствия примеси в препарате ДНК. 3) Максимум поглощения фенола расположен прн 270 нм.
Отсюда следует, что отношение А272/Аыэ достаточно чувствительный показатель загрязнения препарата нуклсиновой кислоты фенолом. 22.4.2. Гиперхромизм Основной примесью в препаратах ДНК обычно является РНК. Эти две нуклеиновые кислоты невозможно дифференцировать непосредственно по их поглощению в УФ-области. Определение фракции препарата, соответствующей ДНК, можно провести с помощью измерения гнперхромизма, наблюдаемого прн тепловой деиатурации ДНК 1разд. 22.5).
При этом поглощение препарата чистой нативной ДНК при 260 нм возрастает приблизительно на 40%. Если вторичная структура примесной РНК разрушается РНКазой, то для РНК гиперхромнзма не набл7одается, но если вторичная структура РНК не нарушается, то величина гиперхромизма для нес составляет приблизительно 302/2. Плавленне РНК происходит при более низкой температуре и в более широком температурном интервале, чем в случае ДНК, поэтому кривые плавления для РНК и ДНК легко различаются. Для определения процентного содержания ДНК в препарате необходимо разделить величину гиперхромнзма, связанного с ДНК, на 0,4 и умножить на 100.
22.4.3. Определение концентрации ДНК в реакции с дифениламином Реакция с дифениламином специфична для дезоксирнбозы в ДНК. Хотя наиболее распространенной япля- 125 члсть ч. систвмлтикл ется методика Бертона (разд. 17.5.1), ниже мы приводим методику в модификации Жиля и Мейерса (27), для которой характерна высокая чувствительность. !. 1 мл раствора ДНК помещают в пробирку (16Х Х !25 мм) с завнпчивающейся крышкой и добавляют к нему 1,0 мл 20'/а-ной (вес/объем) хлорной кислоты. 2. Добавляют 2,0 мл ледяной уксусной кислоты, содержащей 4$ (вес/объем) дифениламина. 3.
Добавляют 0,2 мл 0,16'$-ного (вес/объем) раствора ацетальдегнда. 4. Пробу перемешивают и инкубируют в течение ночи при 30'С. 5. Определяют оптическую плотность при 595 и 700 нм и вычисляют разницу. Сравнивают ее с величинами, полученными для стандартов, содержащих известные количества чистой стандартной ДНК (ДНК тимуса теленка или спермы лосося; 5!арпа С)>еп>!са! Со., 5!. Бощз, Мо.), и определяют концентрацию ДНК в пробе.
Эта методика хороша для растворов очищенной ДНК с концентрацией от 5 до 50 мкг/мл. Ее можно применять в ходе изучения гомологин ДНК прн количественных определениях ДНК, связанной с нитроцеллюлозными мембранами. Она особенно полезна в экспериментах по гомологии рРНК, когда необходимо узнать количество ДНК, присутствующей на мембране в конце гибридизации. После измерения радиоактивности мембраны удаляют из сцинтилляционной жидкости (используют смесь на основе толуола для того, чтобы мембраны не растворялись и радиоактивность не вымывалась) н сушат на воздухе.
Затем мембраны помещают в 10э/>-ную хлорную кислоту (2 мл) и нагревают в кипящей водяной бане в течение 5 мнн. После охлаждения проб до комнатной температуры осуществляют описанный выше этап 2. 22.4.4. Определение РНК в реакции с орцином Орпин применяется для определения концентраций РНК, хотя в ограниченной степени он реагирует и с ДНК Подробно эта методика описана в разд. 17.5.2.
!26 м ггиетическля хАРлктегистнк! 22.5. СОСТАВ ОСНОВАНИЙ ДИК Существует несколько методов определения молярных процентов гуанина и цитозина (мол. а!а О+С) в ДНК, которые мы перечислим ниже: 1) гидролпз и последующее разделение нуклеотидов нли пуриновых нли пирнмидиновых оснований; 2) определение плавучей плотности; 3) определение температуры плавления (денатурации); 4) бромирование [58); 5) апуринизация [3?); 6) определение отношения Ам01Ам0 в буфере с низкой нонной силой при рН 3 [25); ?) жидкостная хроматография под высоким давлением нуклсотидов или свободных оснований [14, 39]. Примесь 1>НК мешает определению всеми этими методами, за исключением методов, основанных на измерении плавучей плотности и температуры плавления (Т ), поэтому последние стали наиболее популярными. 22.5.1. Метод, основанный на измерении плавучей плотности Этот метод включает аналитическое ультрацентрифугирование, описание которого выходит за рамки данной главы.
Он описан Манделем и сотр. [42[. 22.5.2. Метод, основанный на анализе кривых плавления Впервые корреляция между температурой плавления (Т ) и составом оснований ДНК была описана Мармуром и Доти [45[. Мандель и др, [41) и ДеЛей [18] повторно исследовали эту корреляцию и также пришли к выводу о наличии связи между значениями Т н плавучей плотности.
Феррагут н Леклерк [23) сравнили методы определения Т по кривым плавления. На значение Т сильно влияет ионная сила используемого буфера, причем это характерно для всех препаратов ДНК. Следовательно, необходимо либо знать ионную силу применяемого буфера, либо использовать стандартный препарат ДНК, имеющий ту же ионную силу, что и неизвестные образцы. Последнее легко сделать: следует просто диализовать все препараты ДНК (включая стандартную ДНК) в одной и той же партии буфера. ЧАСТЬ У.
СИСТЕМАТИКА Методика Эта методика достаточно надежна, ее можно использовать пе только с приведенными ниже, но и с другими буфсрамп. 1. Готовят 2 — 4 л буфера 0,5Х 5ЯС (равд. 22.2,1), рН 7,0. Часть буфера оставляют для разбавления препаратов ДНК и для промывания кювет непосредственно перед тем, как вносят в них образцы ДНК. Оставшееся количество делят на 2 равные части так, чтобы во время диализа можно было один раз сменить буфер (см. этап 3). 2. Готовят пробы ДНК по 2 — 5 мл (в зависимости от размера используемых кювет) с концентрацией 50 мкг1мл, применяя для разбавления исходных препаратов ДНК буфер 0,5Х 55С. Готовят !Π— 20 мл раствора ДНК-стандарта (например, известно, что содержание О+С в ДНК Е.
сой Ь равно 51 мол.%, а температура плавления Т в буфере 55С 90,5'С), поскольку ее необходимо провести через все стадии анализа. 3. Диализуют одновременно все препараты в течение Рис. 22.3. Кривые плавления для двух образков ДНК, полученные с помощью регистрирующего спектрофотометра, Точки пересечения любой вертикальной линии с кривыми поглощения и температуры представляют собой значения этих параметров в данное время. Точки перегиба на кривых плзвления соответствуют температурам плавления (Т„). бремя— !28 ТК ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ночи в буфере 0,5;к',ЗЗС.
После первых нескольких часов диализа буфер заменяют. По окончании диализа препараты ДНК снова переносят в пробирки с завинчиваюшимися крышками. 4. Определяют кривую плавления с помощью регистрирующего спектрофотометра с термостатируемой ячейкой для кювет, в которую вмонтирована термопара. 5. Определяют значения Т, как показано на рис. 22.3. 6. Вычисляют молярные проценты О+С в образце ДНК с помощью уравнения [26): мол. с6 (6+С)„= = мол. ',~с (6+С)от+1 99(Т.(ю — Тт(сю) где мол. % (О+ С) ., — известные мол. % (О+ С) стандартной ДНК, а Тсчю и Тюссо — значения Тщ для изучаемого образца ДНК и стандартной ДНК соответственно.
22.6. ГОМОЛОГИЯ ДНК Для определения сходства последовательностей нуклсотндов в цепях ДНК (или РНК) у различных организмов изучают гомологию н термостабнльность ДНК (РНК). Прн изучении гомологни можно измерить долю геномов (или долю специфических генов, таких, как гены рРНК), которые при определенной ионной силе н температуре способны образовывать двухцепочечные комплексы. Изучение термостабильности позволяет определить степень ошибочного образования пар оснований в гетеродуплексах (гибридах).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
