Методы общей бактериологии (том 3) (947294), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Существует два общих метода изучения гомологин. Первый из них, который часто называют мембранным методом, заключается в следующем. Сначала иммобилизуют денатурированную (одноцепочечную) немеченую ДНК на ннтроцеллюлозном фильтре, иа котором добавляемая двухцепочечная ДНК не адсорбируется. Затем этот фильтр инкубируют в присутствии фрагментов радиоактивной денатурированной ДНК (или РНК, если изучается гомология РНК). Двухцепочечные комплексы цепей ДНК с радиоактивными цепямн ДНК (нли цепя- 129 чАсть ч. систямлтикА ми РНК в случае изучения гомологни РНК), образующиеся в результате специфического взаимодействия, при последующем промывании фильтра не разрушаются, и пх количество можно определить, измерив радиоактивность фильтра. Другой метод изучения гомологин, который можно назвать методом реассоциации в растворе, основан на связывании одноцепочечных нуклеиновых кислот в растворе, т.
е. в даняом случае, в отличие от мембранного метода, когда один из компонентов связан, оба кампонента находятся в растворе. За реассоциацией цепей ДНК можно следить с помощью ультрафиолетовой спектрофогометрин или, в случае инкубации неболыпого кошшества денатурированной ДНК с высокой удельной радиоактивностью в присутствии большого избытка не- меченой денатурированной ДНК, с помощью измерения радиоактивности. В последнем случае способность меченых фрагментов образовывать двухцепочечные комплексы с немеченой ДНК количественно определяют по адсорбции на гндроксилапатите или по устойчивости к гндролизу нуклеазой $1. Оптические методы определения реакций в растворе в данной главе не рассматриваются. Они описаны в работах 11, 6, 12, 19, 51 н 59).
22.6.1. Специальное оборудование для изучения гомологии ДНК На рис. 22.4 — 22.7 изображены некоторые специально сконструированные устройства для изучения гомологни ДНК. Реакционные сосуды (рис. 22.5) представляют собой пирексовые трубки с внешним диаметром 6 мм, нарезанные на отрезки длиной 2,2 см и запаянные на одном конце. Трубки закрывают пенициллиновыми пробками с обрезанными краями. Растворы наливают в реакционные сосуды с помощью автоматических микропнпеток со сменными наконечниками (рнс. 22.4, Д). Общий объем жидкости в каждом сосуде 110 мкл. Такого количества как раз достаточно для покрытия мембран, помещаемых в сосуды при изучении гомологии ДНК мембранным методом (рнс.
22.5); в случае применения метода реассоциацин в растворе такой объем ~зо тт. Геиетическля хлРАктеРнстикл Рис. 22.4, Приспособления, используемые для изучения гомологии мембранными методами. Л. Плексигласовый штатив для пробирок, поторые иакубируют в водяной бане. На фотографии видны 5 пробирок, установленных в штативе (см, также рис.
22.5). Б. Плексигласовый штатив, в который устанавливают пробирки во время их заполнения. В. Плексиглзсоная камера для мембранных фильтров. Видны верхняя и нижняя панели. В правой части нижней панели установлены 5 фильтров (см. также рис. 22.5). Г. Пробойник для вырезания продолговатых мембранных фильтров. Д. Автоматвческая микропипетка с заменяемым кон шком, использусчая для добавления компонентов в реакционные смеси.
Фото Н, Крига. позволяет отобрать 100 мкл пробы для нанесения на гидрокснлапатнт илп для реакции с пуклеазой В1. Компоненты вносят в реакционные сосуды, установленные в плексигласовый штатив (рис. 22.4, А) с двойным рядом отверстий, позволяющий наблюдать за нх внесением. После заполнения сосуды закрывают пробками и устанавливают в плексигласовом штативе (рис. 22.5) в водяную баню для инкубации. Размер бани долгкен быть достаточным для того, чтобы штатив был полностью погружен в воду, а колебания температуры пе должны превышать ч-0,1'С. При неполном погружении штатива возникает опасность испарения и скопления капель чистой воды на стенках сосудов и крышках, что сильно влияет на ионную силу и концентрацию нуклеиновой кислоты.
При применении мембранного метода пользуются продолговатыми мембранными фильтрами (ЗЛ9 мм), которые вырезают пз больших фильтров (днаметром до !5 см) с помощью пробойника (рнс. 22.4, Г; номер по каталогу 5302, МсВее Вуз(етз, !и ЧАСТЬ Ш СИСТЕМАТИКА Рис. 22лй Крупный план. фрагмента фотографии штатина для реакционных пробирок, изображенного на рнс 22.4. Видны мембранные фильтры, погруженные в реакционную смесь в про. бирках. Пробирки плотно закрыты пробками от пенициллиновмх флаконов с обрезанными выступами.
Фото Н. Крита. 66 ИИ Флчьглр нижняя панель Рис. 22.6. Поверечный срез плексигласовой камеры для отнывкн мембранных фильтров. Рнс. 22.7. Схематическое изображение устройства для определения термосгабильности гибридных двухцепочечных комплексов. Отрезок стеклянной трубки диаметром 7 мм (!) закрыт резиновой пробкой (3), вырезанной из большой резиновой пробки с помощью спепиального сверла. Мембранные фильтры (б) и тефлоновые прокладки (б) насажены на буланку (4) ближе к ее головке.
Острие булавки вставлено в резиновую пробку. Трубка с булавкой находится в стеклянной пробирке (2) размером 1ЗХ10 мм, содержащей 1,2 мл буфера 0,5Х55С, Пробирку помещают в нагретую водяную баню. 132 22. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Доапоке 1ГА 23224). Форма фильтров может быть и иной, ио продолговатый фильтр удобен тем, что он располагается в сосуде под углом (рис.
22.5). Такая форма обеспечивает максимальный контакт фильтра с раствором и высокое значение отношения поверхности к объему, а также облегчает его внесение в сосуд и извлечение. Мембранные фильтры отмывают от непрореагировавших радиоактивных фрагментов в плексигласовой камере с 120 ячейками (рис.
22.4, В и 22.6). Камера состоит из верхней и нижней панелей; мембранные фильтры помещают в нижней панели, после чего привинчивают к ней болтиками верхнюю панель. В собранном виде камера достаточно компактна, она помещается в 400-мл химический сосуд. Фильтровальные устройства, используемые для приготовления ДНК-мембран 1мембран, к которым присоединена денатурированная ДНК), имеют встроенные фильтры из пористого полиэтилена. Основанием устройства служит невысокий цилиндр из плексигласа с таким же внешним диаметром, как у мембраны.
Пористый полиэтилен доверху заполняет внутреннюю часть цилиндра. От основания цилиндра отходит выходная трубка с зажимом для регулирования скорости потока. Верхняя часть прибора состоит из плексигласового цилиндра с неопреновой прокладкой 1толщнной 3 мм), приклеенной к его нижнему краю. Верхнюю часть помещают на мембрану и закрепляют пружиной. Все приспособления из плексигласа можно изготовить в механической мастерской. Термостабильность связанных с мембраной двухцепочечных комплексов можно определить с помощью устройства, изображенного на рис.
22.7. 22.6.2. Получение меченой ДНК: метод 1п 21ко Для опытов по изучению гомологии можно вводить метку в ДНК 1п ч1чо или 1п ч11го. Введение метки в ДНК 1и Р1чо зависит от среды, необходимой для выращивания микроорганизмов, а также от включаемых ими предшественников нуклеиновой кислоты, Среди 'Н- илн '"С-предшественников нуклеиновых кислот чаще других используют аденин, тимидин и де- 1ЗЗ члсть ч.
системлтикА зоксиаденозин. Их включение обычно не подавляется дрожжевым экстрактом до концентрации его в среде 0,11;. В некоторых случаях дрожжевой экстракт используют для подавления биосинтеза предшественников, что позволяет осуществлять их непосредственное включение в ДНК. Пригодность того или иного меченого предшественника можно легко определить, поместив его в пробирку со средой, инокулирован~ой испытуемым организмом. После того как культура вырастет, с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика измеряют радиоактивность культуры, а также надосадочной жидкости после удаления клеток центрифугированием.
Снижение числа импульсов в надосадочной жидкости по сравнению с культурой свидетельствует о включении метки. Включение "РО4' или "РО4' наиболее эффективно проходит в среде без пептона, содержащей не более 1,5 10 — ' М фосфата. Если для роста культуры требуются пептоны и в особенности дрожжевой экстракт, фосфат можно удалить осаждением его в виде бариевой, кальциевой или магниевой солей. Методика Ниже приводится методика, описанная Хайесоы и Гросом [311. 1. 100 г дегидратированного питательного бульона (РИсо) и 50 г казаминовых кислот (РИсо) растворяют в 900 мл воды.
2. Добавляют 50 мл 1 М ацетата бария. (При использовании других пептонов или дрожжевого экстракта необходимо путем титроваиия определить точное количество ацетата бария.) Осадок удаляют фильтрованием. 3. К фильтрату добавляют 5 мл 1 М сульфата натрия, оставляют на 15 мин и снова фильтруют. Проверяют наличие остаточного бария с помощью родизоиовой кислоты (осадок красного цвета, выпадающий в результате образования бариевой соли роднзоновой кислоты, можно наблюдать при концентрациях, в 10 раз меньших, чем при осаждении в виде Ва50,). 4. Доводят объем до 1 л и используют в виде концентрата (1ОХ) для приготовления меченой среды.
~З4 ы генетичесххя хлгхктеяистикл 5. Выделяют ДНК из меченых клеток по методу, описанному в равд. 22.2, и растворяют ее в буфере 0,1Х 55С. В опытах по определению гомологии мембранным ме;одом (равд. 22.6.5) используют ДНК в концентрации от 50 до 100 мкг/мл (удельиая активность должна составлять не менее 10 з имп/мин ° мкг). Если применяют метод с использованием гидрокснлапатита или нуклеазы 51, то ДНК с удельной радиоактивностью 0,5 10' — 2,5Х Х!0' имп/(мин мкг) берут в концентрации не более 5 мкг/мл.
При низкой концентрации ДНК добавляют около 30 мкг на 1 мл препарата фрагментированной ДНК из спермы лосося во избежание адсорбции меченой ДНК на стекле. Препарат ДНК дважды пропускают через пресс Френча под давлением 11,2 10' Па. 22.6.3. Получение меченой ДПК: метод 1п чИго ДНК можно иодировать "Ч, получая активность более !О' имп/мин мкг. Мы не рассматриваем здесь процедуру иодировання, подробное описание ее дано в работах (16, 49, 52, 56!. Другим способом введения метки в ДНК (п чйго, который находит все более широкое применение, является «ник-трансляция» !15, 37, 46, 50ь В этом случае сначала ДНК инкубируют с панкреатическойДНКазой1, под действием которой в ДНК образуются одноцепочечные разрывы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
