Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Процедуру повторяют дважды со свежим !чог11 А. Таким образом получают 1О!7О-ный обесцвеченный раствор казаминовых кислот.) 6. Инкубируют чашки около 18 ч при 30'С или до тех пор, пока колонии трансдуцированных бактерий не станут видны невооруженным глазом. 7.
Методом отпечатков переносят колонии и чашки со спектиномицином или стрептомицнном (равд. 13.9.19) и в чашки с минимальным агаром (равд. 13,9.10), содержащим 0,3'/а казаминовых кислот. 8. Чашки с минимальным агаром инкубируют при 44'С, а чашки с антибиотиками при 30'С. После инкубации исходных чашек н чашек-копий при соответствующих температурах в течение еще 24 ч чашки совмещают для выявления колоний, устойчивых к антибиотикам, и колоний, не способных расти при 44'С.
9. Отбирают отмеченные колонии из исходных чашек, очищают клоны выделением из единичной колонии и вновь проверяют на наличие различных селективных свойств. Возможные трудности Фаг Р1 образует очень маленькие стерильные пятна, которые трудно различить в старых чашках. Чтобы свести к минимуму эту проблему, используют только толстый слой агара (30 — 35 мл), залитого в чашки не ранее чем за 8 — !2 ч до использования. Пятна диаметром больше 1 мм наверняка относятся к примесям (обычно фаг Т1). Из лизата на одной чашке обычно имеют от 1 10" до 5 10" фаговых частиц. Достаточное для эксперимента по локальному мутагенезу количество бактериофага Р! получают с 20 — 30 чашек. В норме трансдукция с использованием 10' фаговых частиц Р1 дает от 200 до 2000 трансдуктантов.
Метод отпечатков может быть применен, если число трансдуктантов составляет менее чем 300 на чашку. Поэтому для определения соответствующего количества посевного материала рекомендуется провести пробный экспери- 47 чАсть н1. ГенвтикА мент, Чтобы обеспечить выделение как устойчивых к антибиотикам, так и условно летальных мутантов, следует проанализировать всего приблизительно 5000— 10 000 колоний трансдуцированных бактерий. 13.8.2. Мутагенность канцерогенов (тест Эймса) Таблица 18.4.
Штаммы рода Ва1шоне11а, используемые для выявления мутагенности" Мутация гена Н-фак- тор твл мз тецня Другие дефекты и!тамм Замена оснований Сдвиг рамки То же Замена оснований Сдвиг рамки То же ТА 1535 ТА 1537 ТА 98 ТА 100 ТА 1538н ТА 1978а г1а, ЛиргВ То же г1а, ипг+ 645 С307б Р3052 045 Р3053 Р3053 Штаммы хранятся у д-ра Эймса, отделеняе бнохнмян, Калнфорняйскяй уннверсятет. Беркли, сд 94720.
б Этн двв штамма разлячамтся лншь по способности к репарации с вырезанием участков ДНК. Сравнеяяе зон тоРможения роста, вызываемого разлнчпымн соеднпеняямя в енот-тесте 1капельном тесте), позволяет оценить летальное действне, обусловленное нонрежденнямя в ДНК. Химические канцерогены — это вещества, с большой вероятностью вызывающие образование опухолей у лабораторных животных. Эймс и соавторы [7, 81 показали, что большинство известных канцерогенов одновременно являются и мощными мутагенами.
Способ проверки, разработанный нми, включает простой посев, позволяющий оценить индукцию обратных мутаций в бактериальных генах канцерогенами. Многие канцерогены, прежде чем проявить свое канцерогенное и мутагенное действие, должны быть активированы; в живом организме такая активация обычно происходит в печени подопытного животного. С помощью рассматриваемого теста можно оценить необходимость такого рода активации включением в исследуемую пробу экстрактов печени млекопитающих, полученных после осаждения митохондрий.
Около 85% всех известных канцерогенов яв- лаются мутагенами, в то время как менее 10% неканцерогенных соединений обладают мутагенным действием. Это свидетельствует об относительно высокой степени корреляции между указанными двумя свойствами, а также о том, что значительная часть опухолей млекопитающих может возникать как результат индуцированных соматических мутаций. В тесте Эймса используется группа гнстидиновых ауксотрофов Ба!топе!!а 1урл1тиг1пт. Штаммы этой группы имеют специфические мутации в одном из структурных генов биосинтеза гистидина, включая сдвиг рамки н мутации с заменой оснований (свойства штаммов см. в табл.
13.4). У этих штаммов нарушена система вырезания и репарации (иогВ) и система образования липополисахаридной капсулы, которая в норме покрывает снаружи бактерию (тга). В последнее время были также получены штаммы, содержащие В-фактор (определяемая плазмидами устойчивость к антибиотикам), которые с успехом используются для выявления мутагениости нескольких классов канцерогенов.
Постановка теста заключается в смешивании бактериальных клеток с препаратом ферментов печени, полученным после осаждения митохондрий, и предполагаемым мутагеном в агаре, предназначенном для верхнего слоя, с последующим наслаиванием смеси на соответствующий минимальный агар в чашке. Существует и другой вариант, когда исследуемый агент либо в кристаллической форме, либо в каплях на дисках фильтровальной бумаги, наносят на поверхность агара, в верхнем слое которого присутствуют бактерии и ферментный препарат. Летучие соединения можно изучать при инкубации чашек, содержащих бактерии и микросомы, в эксикаторе, в замкнутое пространство которого введено исследуемое вещество.
Описание дополнительных деталей постановки эксперимента в данном случае см. в работе 18!. Приготовление среды 1. В чашки Петри диаметром 100 мм и высотой !5 мм разливают по 30 мл минимального агара М56 (равд. 13.9.10), содержащего 1,5% агара и 2% глюкозы. ЧАСТЬ 1Н ГЕНЕТИКА 2.
Готовят 100 мл исходного раствора агара для верхнего слоя, содержащего 0,65% агара и 0,5а~г НаС! (равд. 13.9.20). Добанляют к нему Е-гистидин НС1 и биотин до конечной концентрации 0,05 мМ каждый (прилнвают !О мл исходного раствора с концентрацией обоих веществ 0,5 мМ к 100 мл агара верхнего слоя) и хранят при 45'С до использования. Благодаря присутствию небольшого количества гнстидина бактериальные клетки способны несколько раз поделиться, что усиливает мутагенный эффект исследуемых соединений. Приготовление фракций 5-9 Фракцию ферментов (называемую 5-9) готовят следующим образом. 1. Индуцируют синтез микросомных ферментов печени у самцов крыс (линия 5ргадце-Ва1и!еу/В1о-1) весом около 200 г внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл раствора Агос!ог 1254 (полихлорированный дифенил, 200 мг(мл в кукурузном масле). 2.
Кормят крыс смесью Рцг!па 1.аЬ С)1о1ч и позволяют им свободно пить в течение 5 дней. 3. Не дают пищи крысам в течение 12 ч, а затем забивают их оглушающим ударом по голове нли декапитацией после цервикального смещения. 4. Извлекают из животных печени, взвешивают их, промывают стерильным раствором 0,1 М КС1, измельчают стерильными ножницами и в гомогеннзаторе Поттера — Элвехьема с тефлоновым пестиком. При гомогенизацни на 1 г сырого веса печени берут 3 объема 0,15 М ЫаС!; все операции проводят па льду. 5. Центрифугируют гомогенат при 9000 д в течение !О мин и разливают надосадочную жидкость (5-9) аликвотами по 1 — 2 мл в маленькие пластмассовые пробирки.
Быстро замораживают их на сухом льду и хранят при — 80'С до момента использования. В ! мл приготовленного таким образом раствора с концентрацией белка около 40 мг/мл содержатся микросомы из 250 мг (сырого веса) печени. Если имеющееся в лаборатории оборудование не позволяет выделить фракцию 5-9, как описано выше, ее нь мутАции можно купить (равд.
13.10.2). Однако у нас нет опыта работы с имеющимися в продаже препаратами и мы ничего не можем сообщить читателю об нх качестве. Приготовление смеси 5-9 Находящуюся в пробирке фракцию 5-9 оттаивают при комнатной температуре, ставят в лед и используют только в течение одного дня. В эксперименте используют смесь 5-9, в ! Мл которой содержатся: фракция 5-9 (0,04 — 0,1 мл), 8 мкМ МдС!ы 33 мкМ КС1, 5 мкМ глюкозо-б-фосфата, 4 мкМ МАВР и 100 мкМ Ма-фосфатного буфера, рН 7,4. Исходные растворы КАРР (0,1 М) и глюкозо-6-фосфата (1 М) готовят на стерильной воде и хранят при — 20'С.
Таким же образом можно приготовить, проавтоклавировать и хранить в холодильнике исходные соленые растворы (0,4 М МдС1~ — 1,55 М КС1) и фосфатный буфер (0,2 М, рН 7,4). Смесь 5-9 готовят заново каждый день, ее можно хранить в течение нескольких часов во льду. Образцы смеси следует проверять на бактериальное загрязнение. В случае необходимости смесь 5-9 перед использованием фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Приготовление исследуемых веществ Вещества, подлежащие тестированию, готовят и хранят в пробирках разового пользования с завинчивающимися яры~ивами, имеющими изнутри тефлоновое покрытие.
Водонерастворимые вещества обычно растворяют в диметилсульфоксиде. В качестве других растворителей могут быть использованы формамид, п-диоксан, этанол, диметиловый эфир этиленгликоля или ацетонитрил. Выбор растворителя зависит от растворимости исследуемого вещества. Многие вещества можно хранить при — 20'С или в холодильнике; однако вещества с высокой реакционной способностью, такие, как алкилирующие агенты, следует готовить непосредственно перед самым опытом. чАсть пг. ГенетикА Постановка оггыта 1.
Обычно в случае постановки опыта с посевом в чашки с агаром к 2 мл агара верхнего слоя (равд. 13.9.20) при 45'С добавляют 0,1 мл проинкубированной в течение ночи в бульоне ОхоЫ (равд. 13.9.7) культуры штамма, на котором собираются вести испытания. К этим компонентам добавляют также 100 мкл (или больше) испытываемого вещества и 0,5 мл смеси 5-9. 2.
Получившуюся смесь сразу же перемешивают с помощью встряхивателя типа тог1ех, работающего в медленном режиме, или вращением пробирки между ладонями и выливают иа поверхность находящегося в чашке минимального агара с глюкозой (равд. 13.9.10). 3. Осторожными движениями покачивают чашку, чтобы верхний слой агара распределился равномерно. Вся процедура в целом занимает не более 20 с. 4. Дают агару застыть в темноте за несколько минут; затем переворачивают чашку вверх дном и инкубируют в темноте при 37'С. 5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
