Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 4
Текст из файла (страница 4)
При желании непосредственно вслед за ним можно приступить к обогащению культуры по тому или иному мутанту. Если же необходимо получить сразу много независимых мутантов, следует поделить культуру на несколько пробирок еще на этапе добавления 2-аминопурина и затем из каждой отбирать лишь один определенный мутант.
13.2.4. Соединения группы 1СИ Соединения этой группы 1асг(йпе па11-шцз(агбз, обозначаемые также номером с акронимом 1СК, происхождение которого связано с изучением этих веществ в Институте исследований рака (1пз11(п(е 1ог Сапсег Кезеагсп), находящемся в Филадельфии, шт. Пенсильвания] обладают мутагенным действием, обусловленным их интеркаляцией в молекулу ДНК между основаниями, образующими пары в двойной спирали.
Интеркаляция в свою очередь приводит к вставке илн делеции нуклеотидов во время последующей репликации. В результате происходят мутации сдвига рамки, при которых в транскрибируемой молекуле мРНК закодированная информация, подлежащая трансляции, имеет сдвиг в рамке считывания. При этом нарушается последовательность аминокислот за участком вставки или делецни.
Обычно сдвиг рамки ведет к появлению бессмысленного кодона (нонсенс-кодона), и поэтому фенотипически мутанты в данном случае сходны с нонсенс-мутантами, образованными в результате замены оснований: в обоих случаях функция, затрагиваемая мутацией, полностью нарушается. Методика 1. Активно растущую культуру, выбранную для обработки мутагеном, разводят до концентрации 104 клетка/мл минимальной средой (равд. 13.9.8), содержащей 5 — 10 мкг/мл 1СК-191 (поставляется фирмой Ро!узс(епсез, 1пс„%агг1п2(оп, РА 18976).
2. Выращивают культуру до концентрации клеток, для которой светорассеяние составляет 100 ед. при измерении в колориметре Клетта — Саммерсона с использованием красного светофильтра (равд. 11.4.1). Это соот- члсть нь гвнвтикл ветствует приблизительно 10 — 12 циклам деления в присутствии мутагена. 3. Делают посев разведений для отбора мутантов нли предварительно обогащают культуру. Возможные трудности Перед обработкой мутагенами группы 1КС целесообразно изучить рост данной бактерии в средах с возрастающей концентрацией мутагена. Для эксперимента по мутагенезу следует выбрать такую концентрацию, при которой культура еще может медленно расти (время генерации приблизительно вдвое превышает нормальное); в этом случае наблюдается оптимальная корреляция между торможением роста и мутагенной активностью.
Это предшествующее опыту определение важно прн изучении бактерий с различной степенью дефектности рекомбннационной и репарационной систем, так как они могут быть слишком чувствительны к мутагену. Соединения рассматриваемой группы могут усилить индукцию мутаций светом, поэтому, если поставлена цель — получить мутации только сдвига рамки, опыты следует проводить в темноте. 13.2.5. Азотистая кислота Азотистая кислота, относящаяся к химическим мутагенам, вызывает главным образом транзиции в обоих направлениях за счет дезаминирования цитозина и аденина. Кроме этого, по неизвестному механизму она со значительной частотой индуцирует делеции.
Методика 1. Культуру, предназначенную для мутагенеза, в течение ночи выращивают в 5 мл ).-бульона (равд. 13.9.1) или питательного бульона (равд. 13.9.11). Для сбора клеток культуру центрифугируют при 5000 я 5 мин. 2. Осадок промывают 5 мл стерильного 0,1 М Ха-ацетатного буфера, рН 4,6 (равд. 13.9.6). 22 |з, мхтхции 3. Готовят свежий раствор азотистой кислоты (0,05 М нитрит натрия в 0,1 М Ха-ацетатном буфере, рН 4,6).
4. Промытые клетки ресуспендируют в 1 мл азотистой кислоты и инкубируют 10 — 20 мин при 30 — 37'С без встряхивания. 5. Для остановки реакции добавляют 10 мл минимальной среды (равд. 13.9.8 или 13.9.15). 6. После центрифугирования суспензии при 5000 и в течение 5 мин осадок ресуспендируют в среде, пригодной для дальнейшего выращивания н выявления желаемого типа мутантов.
Поскольку обработка азотистой кислотой вызывает гибель значительного числа клеток, следует определить степени выживания клеток путем посева приблизительных разведений на питательный агар (равд. 13.9.12) до и после обработки. Оптимальная степень выживания находится в пределах между 0,1 и 0,01 з/,, 13.2.6. Алкнлирующие агенты Алкилирующие агенты, такие, как этилметансульфонат (ЭМС), диэтилсульфат, метилметансульфонат, модифицируют в ДНК преимущественно пуриновые основания, в первую очередь гуанин. ЭМС, самый распространенный алкилирующий агент в исследованиях по мутагенезу, действует весьма специфично, вызывая в основном транзиции типа ОС вЂ” + АТ 110, 221. Методика 1.
Выращивают культуру бактерий, предназначенную для мутагенеза, в Ь-бульоне (равд. 13.9.1) или питательном бульоне до поздней логарифмической фазы роста (равд. 13.9.11). 2. Смешивают равные объемы культуры и свежеприготовленного исходного раствора ЭМС 10,1 мл ЭМС в 2,5 мл минимальной среды (равд. 13.9.8 нли 13.9.15), подогретой до 37 'С]. 3. Смесь аэрируют на качалке 1 — 2 ч прн 37'С. 4. Разводят культуру в 1О раз свежей минимальной средой н дают ей возможность расти в течение несколь- 23 ЧАСТЬ Н!, ГЕНЕТИКА ких часов. В зависимости от того, какой тип мутанта нужно получить, либо обогащают культуры по этому мутанту, либо непосредственно высевают соответствующие разведения для выявления мутантов. 13.2.7.
Агенты, нзлечивающие клетки от плазмид При добавлении в среду таких веществ, как акридиновые красители, бромнстый этндий, додецнлсульфат натрия и новобиоцнн, а также при повышении температуры из бактериальных клеток могут высвобождаться молекулы плазмидной ДНК (излечнвание бактерий) 120). Плазмидные молекулы, существующие как независимо реплицирующиеся кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, удаляются под действием этих агентов либо из-за нарушения их репликации (вещества акридинового ряда, бромнстый этидий и новобиоцин), либо в результате изменения места их прикрепления к мембране (в присутствии додецилсульфата натрия и при повышенной температуре).
Поскольку плазмидная ДНК играет важную роль в качестве переносчика генетических факторов устойчивости к антибиотикам и тяжелым металлам, а также факторов, детерминнру!ощих антибактериальные агенты и сложные метаболические функции, методы получения бесплазмидных штаммов вызывают большой интерес у исследователей, занимающихся генетикой бактерий. Методика Обычно методика излечнвапня клеток от плазмнд заключается в следующем.
1. Из культуры исследуемого бактериального штамма, находящейся в фазе логарифмического роста, отбирают алнквоты и вносят по 10' — 10' клеток в ряд пробирок с питательным бульоном (равд. 13.9.11), 1.-бульоном (равд. 13.9.1) или какой-либо другой подходящей средой с излечивающим агентом в различных концентрациях. 24 !3. мутАции 2. Инкубируют культуры в течение ночи при обычной для данной бактерии температуре роста.
3. Выбирают культуру, в которой появляется едва заметная мутность, и высевают ее разведения на питательный агар (равд. 13.9.12) или сходную среду. 4. Проверяют отдельные колонии на потерю функций, определяемых плазмидами. Для этого высевают колонии штрихом на агар с антибиотиками (равд. 13.9.4) или наслаивают поверх колоний тонкий слой агара с индикаторным штаммом с целью выявить бактериоцины или другие внеклеточные продукты.
Следует отметить, что оптимальная концентрация агента, излечивающего бактерии от плазмид, может сильно варьировать — в 100 и даже в 1000 раз — в зависимости от того, какая бактерия подвергается обработке, а эффективность излечивания зависит как от штамма, так и от агента, которым обрабатывают клетки. Для излечивания можно использовать также повышенные температуры инкубации (на 5 — 7'С выше нормальной температуры роста). 1.
Выращивают небольшое количество (5 — 10 мл) культуры исследуемого бактериального штамма в питательном бульоне (равд. 13.9.11) или другой пригодной для этого питательной среде до поздней логарифмической фазы при повышенной температуре (43'С для штаммов, растущих нормально при 37'С). 2. Разводят культуру в 20 раз свежей средой и продолжают выращивание при повышенной температуре. В случае необходимости этот этап повторяют. 3. Высевают соответствующие разведения культуры на питательный агар (равд. 13.9.12) или сходную среду для получения отдельных колоний.
4. Проверяют отдельные колонии на потерю функций, определяемых плазмидами, как описано в п. 4 выше. 5. Чтобы подтвердить потерю плазмнд, проводят выделение и фракционирование ДНК по известным методикам (метод выделения плазмидной ДНК см. в гл. 15) и убеждаются в отсутствии плазмндиой ДНК в клетках излеченного штамма. 25 ЧАСТЬ ПЬ ГЕНЕТИКА 13.3. ЭКСПРЕССИЯ МУТАЦИЙ Бактерии могут выжить, имея лишь единственную хромосому; в этом смысле они гаплондные организмы.
Однако динамика их деления и репликации хромосомы такова, что почти при любых условиях роста среднестатистическая бактериальная клетка содержит от полутора до двух полных хромосом. Поэтому в культурах, высеянных сразу же после обработки мутагеном„возникшие мутации с потенциально рецессивным фенотипом (например, связанные с ферментативной функцией) могут маскироваться присутствием неизмененной хромосомы в тех клонах, в которых последняя имеется. В связи с этим целесообразно дать культуре, обработанной мутагеном, расти в течение определенного периода времени и тем самым исключить возможность одновременного присутствия в одной клетке хромосомы, содержащей новую мутацию, и прежней хромосомы.
Длительность этого периода зависит как от времени деления той или иной бактерии при росте в данных условиях, так и от специфики роста. Для видов или штаммов, клетки которых при росте образуют цепочки или гроздья (например, бациллы, стрептококки, стафилококки), этот период больше, чем для штаммов, растущих в виде одиночных клеток, При излишнем затягивании выращивания мутантные клетки сами начинают делиться, и тогда в одной клетке может присутствовать несколько копий одной мутации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
