Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 6
Текст из файла (страница 6)
13.3.2. Анализ обратных мутаций (метод бумажных дисков) Прямой отбор широко используется для получения ревертантов (бактерий с обратными мутациями) ауксотрофных мутантов. Луксотрофы представляют особый класс условно летальных мутантов, не способных выживать без искусственной поддержки извне в виде добавления какого-нибудь соединения — участника обмена веществ (например, аминокислоты, витамина), которое они сами не в состоянии синтезировать. Если ауксотроф возник в результате мутации, связанной с заменой оснований, его можно «ревертировать» (вызвать обратную мутацию, возвращающую к исходному типу) воздействием соответствующего мутагена. Помимо «истинных ревертантов» может возникать множество «фенотипических ревертантов», которые своим появлением обязаны мутациям в локусах, отличных от тех, которые ответственны за первоначальную мутацию Например, мутанты со сдвигом рамки часто могут ревертировать за счет вторичной компенсаторной мутации со сдвигом рамки, расположенной вблизи локуса первой мутации и восстанавливающей правильное считывание триплетов.
Некоторые мутанты с заменой оснований могут ревертировать под действием вторичной мутации, происходящей в другом месте мутировавшего гена. Предполагается, что при этом вторичная мутация частично компенсирует первоначальную мутацию посредством взаимодействия аминокислот, кодируемых мутировавшими локусами гена и расположенных в двух измененных областях белковой молекулы. Мутанты с заменой оснований, в особенности 31 ЧАСТЬ 11!. ГЕНЕТИКА нонсенс-мутанты, могут также «ревертировать» за счет супрессорных мутаций в различных генах, коднрующих синтез тРНК.
Благодаря этим супрессарным мутациям становится возможной трансляция измененной молекулой тРНК бессмысленного кодона в гене, кодирующем белок. Этим, хотя бы частично, исправляется первоначальная мутация. Во всех этих случаях «ревертанты» можно получить прямым отбором, просто высевая большое количество исходного мутаитного штамма иа среду без того метаболита, в котором данный штамм нуждается. Помимо очень большой чувствительности этого метада, который позволяет выявлять единственную бактерию с обратной мутацией на 10' — 10' мутантных клеток, подобного рода анализ предоставляет значительную информацию о природе исходной мутации.
Сравнивая эффективности, с которыми различные мутагены обращают какую-либо мутацию, часто можно судить о там, чтб лежит в ее основе — транзиция или трансверсия, вставка или делеция оснований (сдвиг рамки). Способность мутации обращаться под действием любого мутагена считается свидетельствам того, что эта мутация точковая, а не результат делеции, инверсии или другого типа хромосомных аберраций. Методика, приводимая ниже, предназначена для выявления роста частоты обратных мутаций под действием нескольких часто используемых химических мутагенов, Эта методика с использованием дисков нз фильтровальной бумаги, пропитанных соответствующими веществами [б, 9], позволяет исследовать на мутагенную активность не только аналоги оснований и гидроксиламин, но и алкилирующие агенты (ЭМС), соединения группы 10х (1СК-191), вызывающие преимущественно вставки и дслсции пар оснований (сдвиги рамки), и 1П'Г, сходный по специфичности с ЭМС. На практике отбирают несколько ауксотрофных штаммов интересующей исследователя бактерии, например штаммов, нуждающихся для своего роста в определенных аминокислотах.
Обычно используют серию мутантов, выделенных после обработки различными мутагенами, и сравнивают их способность к реверсии. !х муткцин Методика 1. Выращивают культуру каждого из исследуемых ауксотрофных штаммов до поздней логарифмической фазы роста (с концентрацией около 10' клетка/мл) в 5 мл (.-бульона (равд. 13.9,1) или питательного бульона (разд. !3.9.11) при 37'С, 2.
Среду центрифугнруют и клетки ресуспендируют в равном объеме минимальной среды М56 (равд. 13.9.8) или минимального бульона Дэвиса (разд. 13.9.!5). 3. Наносят аликвоты получившихся суспензий на минимальный агар (равд. 13.9.10), разлитый достаточно толстым слоем (30 мл на чашку). 4. После того как поверхность подсохнет, стерильным пинцетом равномерно располагают на ней 6 дисков из фильтровальной бумаги диаметром 1 см. 5. Наносят на поверхность каждого диска каплю (приблизительно 50 мкл) одного из следующих растворов: стерильная вода (контроль), 5-бромурацил (8 мкг/мл), 1Сй-19! (1 мг/мл), НТГ (1 мг/мл), гидроксиламин (!7 мг/мл) и неразведенный ЗМС. 6. Инкубируют чашки в положении крышкой вверх в течение 4 — 5 сут при 37'С, пока выросшие колонии не становятся легко различимыми.
О вызванных мутагеном обратных мутациях можно судить по кольцам роста колоний вокруг дисков; непосредственно вблизи дисков колоний обычно не наблюдается из-за летального действия мутагенов. По полученной картине, зная преимущественную мутагенную специфичность взятых в опыт соединений, можно определить природу исходных мутаций. Изучение свойств бактерий, претерпевших обратные мутации Описываемый полуколичественный анализ может применяться для того, чтобы отличать полных ревертантов (имеющих первоначальный генотип и фенотип) и от частичных ревертантов, и от штаммов, содержащих не- сцепленные супрессоры. Два последних класса характеризуются сильно замедленным ростом в отсутствие добавки соответствующего питательного вещества.
Из часть нь ганвтикх чашки, в которой ставилась проба с бумажными диска. ми, отбирают колонии разных размеров, наносят их штрихами на минимальный агар для очистки от посторонних мутантов, выращивают в питательном бульоне или делают посев соответствующих разведений на минимальный агар. После 2 — 3 сут инкубации при 37'С определяют относительные размеры колоний. Частичные ревертанты и супрессированные штаммы, как правило, имеют колонии значительно меньших размеров.
В некоторых системах полные ревертанты можно отличить от двух других классов по чувствительности к тому или иному ингибнтору обмена веществ, такому, например, как аналог, ингибируюший рост подавлением синтеза мРНК, кодирующей синтез ферментов. Так, для системы биосинтеза триптофана в качестве аналога, обладающего таким эффектом, может служить 5-метилтриптофан. Прн низких концентрациях этот ингибитор не тормозит синтез триптофана у полных ревертантов, однако практически полностью прекращает его в штаммах, которые синтезируют триптофан в ограниченных количествах. Чтобы показать это, наносят по 10' — 10' клеток исследуемых штаммов на минимальный агар в чашки (равд.
13.9.10 или 13.9.15). Так же как в случае пробы на обратные мутации, наносят каплю раствора 5-метилтриптофана (1 мкг/мл) на стерильный диск фильтровальной бумаги. Зона торможения роста вокруг диска бумаги будет значительно больше для частичных ревертантов и супрессированных штаммов, чем для полных ревертантов. Можно также нанести клетки разных штаммов с обратными мутациями прямо в чашки на минимальный агар, содержащий 5-метилтриптофан (0,01 мкг/мл), и сравнить скорости их роста с наблюдаемыми на минимальном агаре без аналога. Более трудоемкий и требующий больших затрат времени метод различения полных и частичных ревертантов и супрессированных штаммов включает изучение активностей ферментов в рамках тех биохимических функций, которые затрагиваются соответствующей мутацией.
Если такую функцию нетрудно проверить, можно сравнить количество и стабильность фермента у различных ревертантов и бактерий дикого типа. Подобного рода анализ, однако, может привести к неправильным выводам из-за ~з. мэтлции существования регуляторных воздействий мутаций в структурных генах на количественный уровень синтезируемых в клетке ферментов. Например, в случае триптофановой или других репрессируемых фермснтных систем дерепрессия в отношении деятельности ферментов системы более выражена у частичных ревертантов и супрессированных штаммов, чем у клеток дикого типа, так как конечный продукт у первых синтезируется в ограниченных количествах, что приводит к своего рода голоданию клетки. Тот или иной фермент в клетках с частично обращенной мутацией может иметь очень низкую удельную активность, но его фактическое количество (по отношению к общему белку клетки) может в результате дерепрессни стать в неколько раз больше, чем у дикого типа (см., например, работы 16, 91).
13.6. НЕПРЯМОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ МУТАЦИИ Большинство мутантных типов нельзя выявить методами прямого отбора, описанными в предыдущем разделе. Для любой мутации, связанной с потерей генетической функции, требуются такие методы выявления, которые позволили бы идентифицировать очень редко возникающий тип мутанта на большом фоне немутантных клеток. В эту группу входят ауксотрофные мутанты, мутанты с изменениями в системе сбраживапия углеводов, морфологические варианты различных типов и другие условно летальные мутанты.
Самыми распространениымн методами непрямого выявления таких мутантов являются случайный поиск соответствующих колоний н метод перепечатывания колоний с одной чашки на другую (метод отпечатков). Оба метода требуют проверки большого числа бактернальных колоний. По существу, эти методы отличаются только способом осуществления этой проверки. В методе случайного поиска одномоментно со среды на среду переносится одна колония — пока не обнаружится вызванное мутацией нарушение. Это утомительная и требующая больших затрат времени процедура.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
