Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Если хотят получить ряд независимых мутантов одного типа, то лучше всего еще во время индукции мутаций мутагеном или сразу же после нее поделить культуру на порции и затем из каждой порции отбирать после периода выращивания только по одному мутанту. Как было отмечено ранее в описании методов мутагенеза, если время обработки мутагеном достаточно велико, то выращивание проводят одновременно с индукцией мутагеном, тем самым устраняя необходимость в проведении дальнейшего выращивания. !3.4. ОБОГАЩЕНИЕ МУТАНТНЫМИ КЛЕТКАМИ Обычно возникновение мутаций, даже в том случае, когда их вызывают сильными мутагенами, — относительно редкое событие.
В популяциях бактерий частота му- ~з. мктхции таций может быть, например, такой низкой, как 1 мутант на 10' — 10' клеток. Выделить мутант, присутствующий на обильном фоне немутировавших клеток, может оказаться нелегко, особенно если применяются непрямые методы выявления, В таких случаях перед выделением мутанта из культуры, подвергнутой действию мутагена, вводят этап обогащения.
В самой распространенной методике обогащения используется антибиотик пенициллин 111, !8!. Когда культуру, содержащую как мутанты, так и немутировавшне клетки, выращивают на искусственной среде, в которой мутантные клетки не растут, пенициллин избирательно вызывает гибель активно делящихся немутировавших бактерий, нарушая в них процесс синтеза клеточной стенки. В оптимальных условиях можно достичь 1000-кратного обогащения мутантами по отношению к немутантам. 13.4.1. Обогащение с помощью пенициллина 1. Выращивают культуру, подвергнутую предварительному действию мутагена, до ранней логарифмической фазы роста (оптическая плотность при длине волны 600 нм — около 0,1, или 15 — 20 ед.
при 660 нм по шкале Клетта). 2. Добавляют 10 000 ед. пенициллина О на 1 мл среды и продолжают инкубацню культуры на качалке до тех пор, пока не прекратится увеличение мутности (обычно 60 — 90 мин). 3. Удаляют пенициллин либо фильтрованием через стерильный мембранный фильтр (например, фильтр с диаметром пор 0,45 мкм), либо инактивацией его пенициллиназой. Последний вариант применяют для бактерий, которые при фильтровании резко уменьшают пропускную способность фильтра. Обычно добавляют 100 ед.
пеницнллиназы на 1 мл и инкубнруют 30 мин при температуре выращивания. 4. После центрифугирования при 5000 и в течение 5 мин или фильтрования (см. выше) один раз отмывают клетки свежей культуральной средой и вновь суспендируют их в ней перед проведением этапа отбора или поиска. ЧАСТЬ Ш. ГЕНЕТИКА 13,4.2. Обогащение с помощью циклосерина Показано, что помимо пенициллина эффективным препаратом, способствующим обогащению культуры спонтанно возникающими мутантами у различных видов рода Рзеис)отолаз, является аминокислотный аналог— 0-циклосерян [21].
При добавлении его в количестве 100 мкг/мл в сочетании с пенициллином к растущей культуре Рзеиг)отопаз Ри1Ыа он вызывает селективный лизис немутировавших клеток. При этом в течение !в 2 ч культура обогащается мутантами в 100 — 1000 раз, Преимущество двойной обработки перед использованием только пенициллина или только циклосерина заключается в том, что в первом случае не выживают спонтанные мутанты, которые устойчивы к каждому из антибиотиков по отдельности.
Проведя несколько последовательных циклов обогащения двойной обработкой, можно увеличить относительное содержание в популяции мутантных клеток до значения !О' и выше и тем самым получить реальную возможность выделить мутант, возникающий с очень низкой частотой. 13.5. ПРЯМОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ МУТАНТОВ Мутанты, которые приобрели какую-либо активность, отсутствующую у немутнровавших клеток, могут быть выявлены прямым отбором на соответствующей среде.
К таким мутантам относятся клетки, ставшие устойчивыми к различным антибиотикам, бактериофагам илн химическим ингибиторам, обладающим в норме бактерицидным или бактериостатическим действием по отношению к немутнровавшим родительским формам. Прямым отбором могут быть выделены также мутанты, способные к утилизации нетрадиционных источников углерода или азота. Благодаря высокой разрешающей способности прямого отбора (т. е. способности выявлять немногочисленные мутантные клетки на обильном фоне немутировавших клеток) при его использовании обычно не возникает необходимости в каких-либо приемах по обогащению культуры мутантами. К тому же, поскольку типы генетических функций, подлежащие прямому отбору, ожидаются как доминантные по отношению к их !З.
МУТАЦИИ нормальным аналогам в клетках, имеющих более чем одну хромосому, как правило, нет нужды в дополнительном подращивании культуры, подвергнутой действию мутагена, перед высевом на селективную среду. Одна из основных трудностей при прямом отборе состоит в выборе оптимальной концентрации селективного агента. Например, при отборе мутантов, устойчивых к различным антибиотикам, важно подобрать такую концентрацию антибиотика, которая полностью блокировала бы рост бактерий дикого типа, но в то же время позволяла бы развиваться устойчивым мутантам. Определение оптимальной концентрации методом проб и ошибок может потребовать много времени и сил.
В первом примере, приведенном ниже, описан простой метод создания градиента концентрации какого-либо агента в чашке, который можно модифицировать для выявления различных типов мутантов, упоминавшихся выше. Во втором примере описывается простой метод бумажных дисков, используемый для индукции и прямого отбора ревертантов ауксотрофных мутантов. 13.3.1.
Устойчивость к антибиотикам Мутанты, устойчивые к антибиотикам, выделить довольно легко, а сами значения устойчивости могут служить удобными генетическими маркерами, характеризующими бактернальный штамм. В данном примере описывается метод получения спонтанно возникающих мутантов [24), Приготовление градиентного агара в чашках 1. В стерильные чашки Петри диаметром 100 мм наливают по 10 мл автоклавированного питательного агара (равд. 13.9.12) и оставляют его остывать при таком наклоне чашек, чтобы получался скошенный агар (рис. 13.1).
2. После того как агар застывает, чашки ставят горизонтально и наливают в каждую еще по 10 мл агара с одним нз антибиотиков (равд. 13.9.14): сульфатом стрептомицина (100 мкг/мл), пенициллином (500 мкг/мл) или рифампином (50 мкг/мл). ЧАСТЬ П!. ГЕНЕТИКА Рис. 13.1. Приготовление агара в чашках для выделе. ния мутантов, устойчивых к антибиотикам.
Вверху— первый этап; внизу — второй этап, 1 — питательный агар. 2 — агар с антибиотиком В результате получается градиент концентрации антибиотика, возрастающий от низких значений у левого края чашки до высоких значений у правого края. 3. Агару второго слоя дают возможность остыть на горизонтально выставленном столике. В результате формируется градиент концентрации антибиотика от 0 мкг/мл на одном из краев чашки до максимальной концентрации (50 †5 мкг/мл) на противоположном. 4.
Отмечают края с указанием направления градиента. Чашки с агаром готовят не позднее чем за 24 ч до использования, чтобы успел сформироваться градиент концентрации антибиотика. Метод выделения мутанта 1. Выращивают культуру интересуюшего прототрофного штамма, выделенного нз отдельной колонии, до середины логарифмической фазы роста в ).-бульоне (равд. 13.9.1) или питательном бульоне (разд. 13.9.11). 2.
Равномерно распределяют образцы культуры объемом 0,1 мл каждый по поверхности агара в чашках с градиентами антибиотика (равд. 13.9.14). 3. Инкубируют чашки в течение 24 — 36 ч. 4. Отбирают устойчивые к антибиотику колонии стерильной петлей и высевают штрихом на вторую градиентную чашку в направлении возрастания концентрации антибиотика с целью определить их приблизительный уровень устойчивости. 5.
После второй инкубации отбирают отдельные колонии и испытывают в чашках с тем или иным антнбио- )з м»тамии тиком в отсутствие градиента (равд. !3.9.14). Антибиотики добавляют в разной концентрации, чтобы по полученным результатам можно было оценить устойчивость к ним бактерий. В том случае, если нужна высокая степень устойчивости к антибиотику, штаммы, полученные после первого цикла отбора, можно вновь нанести в чашки с агаром, нмеюшим в 5 — 10 раз более крутой градиент концентрации антибиотика, и затем провести процедуры, как описано выше.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
