Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 3
Текст из файла (страница 3)
13.3). 14 и. мхтхции Возможные трудности Относительное число клеток, погибших при облучении ультрафиолетом, сильно зависит от источника облучения и условий эксперимента. Для стандартизации условий облучения следует построить кривую выживания. В слишком концентрированных бактериальиых суспензиях (5 10' клетка~мл) при облучении имеет место аффект зкранирования, обусловливающий неодинаковый процент гибели клеток. Оптимальные результаты дает доза в среднем около 500 эрг/мм', и, если есть возможность воспользоваться дозиметром, нужно ориентироваться на зту цифру. Поскольку ультрафиолет — относительно слабый мутагенный фактор, наилучшие результаты получают при норме выживания от 0,1 до 1%. Наконец, следует по возможности уменьшить аффект фото- реактивации.
Этого добиваются точным соблюдением условий получения ультрафиолета (без примеси видимого света) и последующим выращиванием бактерий в полной темноте. 13.2.2. Нитрозогуанидии Соединение с метильной группой Н-метил-Н'-нитро- 51-нитрозогуанидин (НТГ) — один из самых мощных известных в настоящее время мутагенов бактерий. Он вызывает главным образом транзиции типа ОС вЂ” АТ, значительно реже — транзиции типа АТ вЂ” эОС, трансверсии и даже мутации со сдвигом рамки. Методика 1. Выращивают клетки подходящего бактериального штамма до середины логарифмической фазы (концентрация 5 10' клетка/мл) в 10 мл 1.-бульона (равд. 13.9.1) илн питательного бульона (разд.
13.9.11). 2. Культуру цеитрифугируют в течение 5 мин при 5000 д и осадок ресуспендируют в равном объеме трис-малеинового буфера (разд. 13.9.4), рН 6,0. 3. Добавляют к суспензии свежеприготовленный раствор НТГ (1 мг в 1 мл стерильной воды) до конечной концентрации 100 мкг/мл. Инкубируют 30 мин при 37'С без встряхивания. 15 Таблица 13.2. Свойства некоторых часто используемых мугагенов Относлтекь. наа аффек. тиавость Предполагаемые меканвам мутагенеаа Твп воанвкавщаз мутапви Тип мутагенного фактора Каракгериые осо- Ееивостн Радиация Пренмушественно разрыв хромосом Рентгеновские лучи, быстрые нейтроны Высокая Возможны трудности с оборудованием Делецнн, ннверснн Днмернзацня пнрнмн- динов Ультрафиолет Средняя Транзкцнн типа ОС-ь — АТ, трансверснн, делецнн Химические агекты Относительно ннзкан эф- фективность Ошибки е реплнкацнн ДНК Низкая Гндрокснламнн Индуцирует главным образом транзнцнн ОС-ь -ь АТ Дезамнннрованне цн тознна Низкая Аналогн оснований; 2-амннопурнн 5- бромурацнл, 5- бромдезокснурнднн Преимущественно транзнцнн типа АТ-ьОС Транзнцнн типа ОС-» -ьАТ Мутаген широкого спектра действия, продент гибели клеток должен точно соблюдаться, фотореактнвацня должна быть предотвращена Средняя НТГ Очень высо- кая Средняя Высокая То же Низкая Новобноцин Высокая Азотистая кислота Соединения группы !СР, Акриднновые красители, бромистый этндий Дезаминирование ци- тозина и аденнна Алкилироваиие оснований в репликативной вилке Алкилнрование гуаии- на Интеркаляция между основаниями во время репликации Блокирование репликации ДНК Транзиции в обоих направлениях, деле- ции Преимущественно транзицни типа ОС-~-АТ Преимущественно транзнцнн ОС-ьАТ, отчасти траизиции АТ-ьОС и траисвер- сни Сдвиг рамки за сч ет вставки н делении оснований Сдвиг рамки, потеря внехромосомных элементов Излечивание клеток от плазмид Высокая мутагенность при низком уровне ле.
тальностн, вызывает множественные мутадии на ограниченном участке Мутагенные эффекты, сходные с эффектами НТГ, но меньшая склонность к миожест. венным мутациям к к Соединения могут оказаться труднодоступ- ными Особенно эффективны при излечвванни кле. ток от плазмид Очень эффективен в излечнвании клеток от плазмид чхсгь пь ГенетикА 4. Обработанную суспензию центрифугируют и осадок ресуспендируют в равном объеме минимальной среды М56 (равд. 13.9.8).
5. Суспензию вновь центрифугируют и осадок ресуспендируют в минимальной среде М56 (разд. 13.9.8). Этот метод, предложенный Эделбергом и др. 15], дает большой процент мутантов без излишней гибели клеток, имеющей место в богатой жидкой среде (по крайней мере для Е. со11). Особенно эффективен этот метод для получения ауксотрофных мутантов (равд. 13.6.2). Возможные трудности )уредулреждение. НТГ не только мощный мутаген, но и мощный канцероген! Поэтому всегда необходимо руководствоваться правилами, указанными в конце равд.
13.2. Можно построить кривую гибели клеток под действием НТГ; для этого высевают разведения 10 ' культуры, обработанной НТГ в течение разных отрезков времени с интервалом 5 мин, и исходной необработанной культуры [4). Условия, в которых проводится обработка НТГ, не должны приводить к гибели более чем 50О(, клеток в при повышении концентрации НТГ клеток погибнет больше, но среди выживших до 40% увеличится выход ауксотрофов 151. Одна из потенциальных трудностей в работе с этим мутагеном заключается в том, что он может индуцировать множественные мутации в ограниченном участке бактериальной хромосомы 1121.
У таких мутантов были бы очень сложные требования к питательной среде, так как их мутации затрагивали бы метаболические функции более чем одного типа; к тому же такие мутанты не могут ревертировать к дикому типу с ожидаемой частотой. Поэтому, прежде чем продолжать работу с мутантами, индуцированными НТГ, следует проверить возможность их реверсии к дикому типу (равд. 13.5.2). 13.2.3. Аналоги оснований Аналоги оснований, включенные в молекулу ДНК, такие, как 5-бромурацил и 2-аминопурин, вызывают ошибки репликаций.
Указанные аналоги могут сущест- 13 !3. мутхции вовать в двух таутомерных формах — обычной кето-, или аминоформе, и реже встреча!ощейся енольной, или иминоформе. Каждая из форм имеет свою специфичность в отношении спаривания с другими основаниями. Поэтому переход в более редко встречающуюся таутомерную форму может привести к неправильному образованию пар во время репликации ДНК. Поскольку ошибки в образовании пар могут возникать на двух различных стадиях (в момент включения аналога и во время последующей репликации), они могут приводить к транзициям в обоих направлениях: ОС вЂ” +АТ и, наоборот, АТ вЂ !-С!С.
Однако показано, что и 5-бромурацил, и 2-аминопурин более эффективно вызывают траизиции типа АТ вЂ” ОС, чем С!С вЂ” !-АТ 110, 22). Ни один из этих агентов не имеет болыпого значения в масштабных работах по мутагенезу ввиду их низкой мутагенной активности. Последнее обусловлено, видимо, неспособностью указанных аналогов конкурировать с нормальными нуклеотидами.
Зато эти аналоги полезны при изучении обратных мутаций, где чувствительность метода в отношении выявления редких мутаций высока (равд. 13.5.2). Обработка б-бромурац1илои Чтобы добиться существенного мутагенеза при действии 5-бромурацила, необходимо снизить внутриклеточную концентрацию тимина — природного аналога 5-бромурацила. Это можно осуществить с помощью мутанта, нуждающегося в экзогенном тимине, или предварительной обработкой клеток веществами, ингибирующими синтез тимина и тем самым снижающими уровень содержания в клетке самого тимина и его нуклеотидных и нуклеозидных производных. Тимин в норме синтезируется из дезоксиуридина при участии фермента тимидилатсинтетазы.
В присутствии сульфаниламида — ингибитора синтеза фолиевой кислоты — в растущих клетках происходит истощение донора метильных групп и как следствие уменьшение содержания тиминовых нуклеозидов и нуклеотидов. 1. Клетки соответствующего бактериальиого штамма выращивают в течение ночи в минимальной среде (равд. 13.9.8 или 13.9.15), если по синтезу тимина он члсть пь генетнкл относится к дикому типу (тиминнезависимый штамм), или в минимальной среде с тимином (20 мкг/мл), если штамм дефектен по синтезу тимина (тиминзависимый штамм). 2. Для тнминнезавнсимых штаммов культуру разводят 1: 25 в бульоне с сульфаииламидом (равд.
13.9.5), содержащем 50 мкг 5-бромурацила в 1 мл. 3. Инкубируют на качалке 5 — 6 ч при 35 — 37'С. 4. Культуру центрнфугируют (или фильтруют через бактернальный фильтр) и ресуспендируют клетки в свежей среде, состав которой способствует обогащению н (нли) отбору, требуемым для получения мутанта желаемого типа. 2а.
Культуру тиминзависимого штамма после инкубации в течение ночи центрифугируют, клетки ресуспендируют в минимальной среде (равд. 13.9.8 илн 13.9.15), ие содержащей тимина, но имеющей в своем составе кислый гидролизат казеина (0,1'(о) и 20 мкг(мл 1-триптофана. 1 За. Проводят инкубацию 20 — 30 мин при слабом покачивании для полной утилизации клетками остатков тимина в среде. 4а.
Добавляют 5-бромурацил до конечной концентрации 20 мкг/мл и продолжают инкубацию с покачиванием еше в течение 1 ч. 5а. Чтобы удалить 5-бромурацил, культуру центрифугируют или фильтруют и клетки ресуспендируют в среде, содержащей 20 мкг/мл тимина, во избежание их гибели от недостатка тимина во время дальнейшего роста н (или) процедур отбора. Обработка 2-аминопурином 1. Клетки исследуемой бактерии выращивают в течение ночи в 1-бульоне (равд.
13.9.1) или питательном бульоне (равд. 13.9.11). 2. Культуру разводят свежим бульоном, содержащим 500 мкг/мл 2-амннопурнна, до плотности 10' — 10' клеток в 1 мл. 3. Проводят инкубацню на качалке до тех пор, пока культура не становится мутной. Это длительный этап, во время которого происходит рост клеток и экспрессия 20 !3. мутАции индуцированных мутаций.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
