Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Поэтому иногда такой метод называют подходом «в лоб». Один из способов повышения вероятности выявления нужного мутанта «в лоб» этим методом — использование в каче- ЧАСТЬ НЬ ГЕНЕТИКА стве компонента среды, на которую делают посев, подходящего меняющего цвет субстрата. В одном из примеров такого подхода, который приводится ниже, мутанты, не способные сбраживать лактозу, выявляют благодаря включению в среду красителя тетразолия 115). 13.6.1. Мутанты по системе брожения 1.
Выращивают посевной материал соответствующей сбраживающей лактозу бактерии в ).-бульоне 1разд. !3.9.1) или питательном бульоне (равд. 13.9.11). 2. Подвергают культуру действию мутагена и затем дополнительно выращивают ее, как описано в равд. 13.3. 3. Определяют плотность клеток в культуре с помощью колорнметра Клетта — Саммерсона или какого- нибудь другого прибора для измерения мутности. Делают посев соответствующих разведений в чашки с лактозо-тетразолиевым агаром (равд. 13.9.3) с таким расчетом, чтобы получить 50 — 100 колоний на чашку. 4.
Инкубируют до тех пор, пока колонии не достигают в диаметре 2 — 3 мм. Колонии родительского положительного по сбражнванию лактозы штамма имеют белый цвет, тогда как колонии отрицательные по сбраживанию лактозы ярко-красные. В основе этого различия в окраске лежит выделение кислоты бактериями, сбраживающими лактозу. В слабо забуференной среде выделяющаяся при брожении кислота снижает значение рН и предотвращает восстановление красителя.
В то же время колонии клеток, не сбраживающих лактозу, сохраняют присущую им способность восстанавливать тетразолий до его окрашенной в красный цвет формы. Возможные трудности Важно, чтобы колонии на чашках не были посеяны слишком часто, так как выделение кислоты бактериями в колониях дикого типа может препятствовать восстановлению тетразолия и отрицательными по сбраживанию лактозы колониями. Разведения должны быть подобраны с таким расчетом, чтобы на чашку приходилось не более 100 колоний. Важно также, чтобы лактоза была высококачественная, без примеси глюкозы; иначе 36 13. мутАции результаты могут быть искажены слабым сбраживанием глюкозы, что часто случается при использовании лактозы, содержащей примесь глюкозы (см.
список реактивов в равд. 13.10.2). Эта общая тактика поиска применима для любого мутанта, для которого удается найти подходящий субстрат, позволяющий благодаря изменению окраски различать колонии мутантов. В качестве примеров можно указать на применение и-нитрофенилфосфата для выяв. ления фосфатазных мутантов, красителя Гнмзы или метилового зеленого для выявления мутантов по нуклеазам н диазотированных цронзводных казеина, коллагена или альбумина для выявления мутантов по протеолитическим ферментам.
Солюбилнзация желатины (которая сама по себе не является цветовым индикатором), сопровождающаяся переходом из опалесцирующей формы в прозрачную, уже давно используется для измерения протеолитической активности. Подобным образом нуклеазную активность можно выявлять по солюбилизацин РНК и ДНК, включенных в агар в виде кислотонерастворимых компонентов.
13.6.2. Выявление ауксотрофов (метод отпечатков) В !952 г. Ледерберг и Ледерберг 117! разработали для непрямого отбора бактериальных мутантов метод отпечатков с чашки на чашку. Этот метод, схема которого изображена на рнс. 13.2, позволяет с помощью кусочка бархата (равд. 13.9.16) в один прием переносить большое число колоний с одной твердой среды на другую.
Более того, при этом во второй чашке колонии располагаются точно так же, как в первой. Это позволяет быстро проверять большое число индивидуальных колоний на наличие мутантных признаков. Сначала на неселективную полную среду высевают нужное разведение той культуры, которую подвергли действию мутагена. Затем выросшие колонии «перепечатывают» на селективпую илн минимальную среду. Колонии, которые растут на среде с соответствующей добавкой и не растут на минимальной среде, отбирают и проверяют на наличие мутаций.
Пользуясь этим мето- ЧАСТЬ П1. ГЕНЕТИКА Чашка 1 Чашка ! Чаигла «' д г ашкн Я Чалгка 5 Рис. 13.2. Метод перепечатывания колоний с чашки на чашку (метод отпечатков), предназначенный для отбора ауксотрофных мутантов исследуемого штамма. А. Колонии в исходной чашке, выращенные на полной среде (чашка 1), Б, В. Перепечатывавне колоний на бархат с исходной чашки (чашки 1). Г.
Отпечаток колоний с бархата на агар в чашке с минимальной средой (чашке 2). Д. Отпечаток колоний с бархата на агар в чашке с полной средой (чашке 3). Е. По истечении определенного срока сравнивают рост колоний в чашках 2 и 3 для выявления колоний ауксотрофных мутантов. дом, за короткое время можно проверить несколько тысяч колоний, при этом не нужно отбирать и перевивать каждую колонию по отдельности. Метод отпечатков особенно полезен для выделения ауксотрофов, которые растут на полной среде, но не растут на минимальной. Добавляя к минимальной среде, на которую переносят колонии, определенные вещества, можно выявить ауксо- М 13.
мутлции трофы определенного типа (например, по одной аминокислоте, витамину, предшественнику нуклеиновой кислоты). Если применять высокоэффективный мутаген, такой, как НТГ, этим методом можно получить до 20% ауксотрофов от обшего числа клеток или 1 — 2% мутантов определенного типа. Данный подход иллюстрирует приведенный ниже пример выделения ауксотрофных мутантов различных типов. См. также разд. 20.2.5.
Методика 1. Исследуемую бактерию подвергают действию мутагенного фактора, желательно широкого спектра действия (например, ультрафиолета). 2. Выращивают обработанные клетки в питательном бульоне (разд. !3.9.11), чтобы выявить возникшие мутации. Если нужно получить ряд независимых мутаций, следует перед выращиванием поделить культуру на несколько порций. 3. Высевают необходимые разведения в чашки с питательным агаром (разд. 13.9.12) и инкубируют чашки вверх дном при 37'С. 4. По достижении колониями размера около 3 мм в диаметре «перепечатывают» их в чашки с минимальным агаром (равд.
13.9.10 или 13.9.15) и питательным агаром (разд. 13.9.12). Когда колонии вырастают, выявляют те из них, которые есть на питательном агаре, но отсутствуют на минимальном агаре. На этой стадии (последней из отраженных схемой на рис. 13.2) методика позволяет выявить лишь всю совокупность ауксотрофов; пока нельзя ответить на вопрос, какие именно изменения произошли в тех или иных конкретных звеньях обмена веществ ауксотрофов. Чтобы идентифицировать различные типы ауксотрофов, выполняют следующие дополнительные этапы. 5. Отбирают выявленные колонии ауксотрофов с помощью стерильных зубочисток, размазывают массу клеток пятнами размером 0,6 см в диаметре каждое в чашках с питательным агаром (равд. 13.9.12) и инкубируют при 37'С.
В каждой чашке должно находиться по 40— 50 пятен. члсть пь ГенетикА 6. «Перепечатывают» клопы, выросшие из пятен, на минимальный агар (равд. 13.9.10 или 13.9.15) с добавками метаболитов в девяти различных комбинациях (табл. 13.3) и без добавок. 7. Определяют, прн наличии каких наборов метаболитов растет обнаруженный мутант. Эти данные дают возможность сделать вывод о природе нарушения, вызванного мутацией. Например, мутант, который растет при добавлении 3-го и 6-го наборов, относится, по всей вероятности, к цистеинзависимым мутантам, а 5-го и 9-го наборов — к аргнниновым ауксотрофам. Затем, чтобы убедиться в правильности предварительных выводов, проверяют рост каждого клона на минимальном агаре с той добавкой, от которой, как предполагают, зависит данный ауксотроф.
Возможные трудности Некоторые ауксотрофы отвечают только на одну комбинацию добавок или вообще не отвечают ни на одну из них. Первый случай может быть обусловлен следующими факторами: 1) двумя независимыми мутациями, приводящими к потребностям в разных питательных веществах, которые могут находиться в одном наборе метаболитов; 2) мутацией, затрагивающей один нз первых этапов разветвляющегося метаболнческого пути (например, штамм с дефектом синтеза полиарома|нческих кислот растет только на среде с добавлением 8-го набора); 3) эффектами ингибировання другими метаболитами набора.
Мутанты, которые вообще не растут прн добавлении любого набора метаболитов, могут быть 1) мутантами, нуждающимися в таком веществе (например, витамине), которое не вошло ни в один нз наборов, или 2) двойными мутантами, зависящими от сочетания двух метаболитов, не вошедших нн в один из наборов. Такие мутанты можно проверить на чашках с добавлением смеси витаминов, нли гидролизатов РНК, или полной смеси аминокислот (например, кислотного гидролнзата казенна, нлн казаминовых кислот, с 1.-триптофаном). Если выделяют ауксотрофы, которые не отвечают ни на один нз предлагаемых наборов, можно попробовать другие добавки, такие, как смеси витаминов, аминокислот нли гидролизаты нуклеиновых кислот [16). 13. МУТАЦИИ 13.7.
ИЗУЧЕНИЕ СВОР1СТВ МУТАНТОВ Когда мутант наконец выделен, часто желательно провести биохимические и генетические исследования, чтобы иметь информацию о природе его генетического дефекта. Например, потребность в питательном веществе может быть вызвана мутациями в нескольких генах. Так, ауксотрофы, не способные синтезировать опреде- Таблица !З.З. Комбинации добавок к минимальному агару' набора Витамин В~ Лизин Пролив Метионин Валин Треонин Аденнн Гистидин Фенилала- нин Глутамино- нан кислота Иистеин Изолейцин Триптофав Гуанин Лейцнн Тирознн Аргинин Алании Аспарагинонан кислота Серии а Все вещества, кроме ввтемнна Вв добавляют в конечной концентрации 20 мкг!мл, витамин В, — в кояечеой ковцентрацан 4 мкг/мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
