Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Через 2 дня инкубацни отмечают колонии гистидиновых ревертаитов и убеждаются в наличии слабого фонового роста бактерий в агаре благодаря небольшому количеству гистидина, добавленного к среде. Чтобы выяснить, нуждается ли то или иное вещество в предварительной активации, имеет смысл проводить испытания как в присутствии, так и в отсутствие смеси 5-9.
Помимо опытных чашек должны быть и контрольные, содержащие: 1) только культуру бактерий, 2) бактерии с известными мутагенами (включая такой, который заведомо требует активации), 3) бактерии со смесью 5-9 (без мутагена). Если мутагены нужно проверить нанесением на диски, их не включают в состав смеси верхнего слоя агара, а наносят позже по нескольку кристаллов, растворенных в воде, спирте или диметилсульфоксиде, на поверхность стерильных бумажных дисков диаметром 5 мм. Для некоторых веществ этот метод мало эффективен, вероятно, из-за их адсорбции на фильтре. В некоторых случаях мутагены наносят непосредственно на поверхность ага- ра, правда, для получения положительного результата с плохо растворимыми веществами требуются довольно большие концентрации. Возможные трудности Предупреждение.
Используемая в экспериментах $. 1урйптиг(ит относится к микроорганизмам, патогенным для человека (класс П). Эта бактерия является одним из главных возбудителей пищевых отравлений и в случае попадания внутрь может вызывать тяжелые формы поноса, рвоты, гастроэптерита. Несмотря на слабую вирулентность лабораторных штаммов, особенно тех, которые лишены липополисахаридной капсулы, обращаться с ними следует очень осторожно. Все пипетки должны быть снабжены ватными пробками, а материал, содержащий эту бактерию, нельзя насасывать в пипетку ртом.
Перед удалением культуры должны автоклавироваться. Сотрудники лаборатории, принимающие антибиотики, должны быть особенно осторожны при работе со штаммами, плазмиды которых детерминируют К-фактор. Большая осторожность необходима и в обращении с высокотоксичными мутагенами, обладающими канцерогенными свойствами. Исследования этих веществ лучше всего проводить в специально отгороженном от остальной лаборатории помещении. Взвешивание опасных материалов и разлив по чашкам агара верхнего слоя, содержащего мутагены, нужно проводить под тягой. Инкубируют пробы также под хорошей тягой, причем вытягиваемый воздух должен поступать в канал, не сообщающийся с общим каналом тяги лаборатории.
Сотрудники должны проводить эксперименты в лабораторных халатах и перчатках, а при работе с летучими препаратами использовать респираторы. При интерпретации результатов нужно учитывать, что метод нанесения исследуемого вещества на поверхность агара (спот-тест), будучи полезным при обследовании большого числа изучаемых мутагенов, дает только качественные данные. Оп мало приемлем для таких химических агентов, которые, как большинство водонерастворимых полициклических углеводородов, не диффундируют в агар.
Даже при использовании более чув- ЧАСТЬ пь Генатикх ствительного и допускающего количественную оценку метода наслоения (внесения исследуемого вещества в расплавленный агар верхнего слоя) важно проверять несколько различных концентраций исследуемых веществ, чтобы определить, имеется ли линейная зависимость индукции обратных мутаций от концентрации. В случае выраженной гибели бактерий исследуемого штамма, что проявляется в ослаблении роста бактериального газона, необходимо убедиться в том, что это происходит на линейном участке кривой доза — ответ, а не при тех концентрациях, когда степень летальности клеток относительно преобладает над мутагенностью.
Степень летальности клеток можно определить сравнением действия данного вещества на нормальный штамм, используемый в пробе, и на штамм с нарушенной системой репарации (иогВ). Другой фактор, влияющий на результаты, — фракция 5-9. Мутагенный эффект может несколько изменяться от одного образца фракции 5-9 к другому, поэтому желательно проверять каждый новый образец в различных концентрациях с несколькими стандартными веществами, такими, как 2-аминофлуорен, 7,12-диметилбензантрацен и афлатоксин В1 18].
Вещество обычно считается немутагенным, если 1 мг этого вещества при исследовании включением в агар не дает двукратного увеличения числа обратных мутаций по сравнению с фоном спонтанных обратных мутаций. Некоторые вещества прн стандартной постановке пробы включением в агар проявляют слабую мутагенность. Для таких соединений чувствительность пробы можно повысить, проведя ЗО-мин преинкубацию в растворе перед посевом. Чтобы провести преинкубацию, смешивают в указанной последовательности в стерильной стеклянной пробирке: 0,1 мл раствора исследуемого вещества, 0,5 мл смеси 5-9 и 0,1 мл бактериальной культуры.
Иикубнруют 30 мнн при 30'С (или 20 мин при 37'С), слабо перемешивая. Добавляют 2 мл агара верхнего слон (равд. 13.9.20), перемешивают и выливают в чашку с нижним слоем минимального агара М56 (равд. 13.9.10). Инкубируют и учитывают колонии, так же как в случае стандартной процедуры. Случается, высокая частота спонтанных обратных мутаций у используемых штаммов смазывает истинную !в.
мутднии 13.9. РЕЦЕПТЫ СРЕД 13.9.1. 1:Бульон (для Е. сой и других энтеробактерий) Гриптон 10 г Дрожжевой акстракт 5 г ХаС1 0,5г Дистиллированная вода 1 л Доводят рН до 7,0 добавлением 1 н. (х!аОН и автоклавируют 15 мнн под давлением 10' Па при 121'С. После автоклавирования добавляют !О мл стерильного 20%-ного раствора декстрозы. 13.9.2. 1:Агар Добавляют 15 г агара на 1 л Е-бульона и разливают по 20 — 25 мл в чашки Петри (!ООХ15 мм). 13.9.3. Лактозо-тетразолиевая среда Среда 1Са 2 (для определения устойчивости к антибиотикам) Дистиллированная вода 2,3,5-Трифенилтетрааолийхлорид (5!Кгпв Сйепнса) Со) 25,5 г 950 мл 50 мг Сначала растворяют среду № 2, затем добавляют к ней тетразолийхлорнд и нагревают до тех пор, пока он не растворится полностью.
Автоклавируют 15 мин прн картину. Как правило, это происходит из-за присутствия в среде мутагенов. Возможно, эти мутагены содержатся в некоторых партиях питательного бульона; поэтому для выращивания штаммов, используемых в опытах, рекомендуется бульон Охо!г! (равд. 13.9.7). Кроме того, отделы1ые партии пластмассовых чашек Петри разового пользования могут содержать значительное количество окиси этилена, мутагенной по своей природе. В настоящее время можяо приобрести чашки Петри, которые не стерилизуются окисью этилена (равд. 13.10.2). чАсть и!. ГвнетикА 121'С, добавляют 15 мл стерилизованного отфильтрованного 20%-ного раствора лактозы после автоклавирования н разливают в чашки Петри размером 100Х15 мм.
13.9.4. Трио-малеиновый буфер (ТМ-буФер) Трис 5 г Малеиновая кислота 5,8 г (МН»)»50» 1,0 г »'е50» 7Н»О 0,25 мг Добавляют дистиллированной воды до 1 л, доводят рН (если это необходимо) до 6,0 и автоклавируют в течение 15 мин при 121'С. Пос»те охлаждения среды до температуры около 50'С добавляют в стерильных условиях: 13.9.8) до- Доводят рН до 4,6 добавлением концентрированной уксусной кислоты. 13.9.7. Бульон Охо(б Среда Охоы»»Г» 2 25 г Листиллирова»»ная вола ! л Стерилизуют автоклавированием в течение 15 мин при 121'С.
М250» 7Н»О 0,1 г Са(НО»)» 5 мг 13.9.5. Сульфаниламидный бульон Минимальную солевую среду М56 (равд. полняют следующими компонентами: Смесь каааминовых Урацил кислот, не содер- 5-Бромурацил жащая витаминов 0,1% 1.-Трнптофан Ксантин 25 мкг/мл Сульфаниламид 13.9.6. Ха-ацетатный буфер НаС»Н»О» ЗН»О 13,6 г дистиллированная вода 1 л 2,5 мкг/мл 50 мкг/мл 20 лщг/мл 1 мкг/мл » з. ми та пи и 13.9.8. Минимальная среда М56 Ма»НРО, 7Н»О 8,2 г КН»РО» 2,7 г (МН»)г50» 1,0 г Ре50,.7Н»0 0,25 мг Добавляют дистиллированной воды до 1 л, доводят рН до 7,2 и автоклавируют 15 мин при 121'С (10' Па). После охлаждения среды до температуры около 50'С добавляют в стерильных условиях: Ми50» 7Н»0 О,! г Са(НО»)з 5 иг Для использования этой смеси в качестве ростовой сре- ды добавляют 10 мл стерильной 20%-ной глюкозы.
13.9.9. Среда М56/2 Среду М56 разводят стерильной дистиллированной водой в отношении 1: 1. 13.9.10. Минимальный агар М56 Готовят минимальную среду М56 (равд. 13.9.8), автоклавируют, добавляют 10 мл 20е(е-ной глюкозы и соответствующие наборы аминокислот и витаминов. 1 объем полученной среды М56 добавляют к ! объему 3,2е(е-ного агара (32 г агара на 1 л воды). Среду и агар автоклавируют порознь при 121'С. Хорошо перемешивают, дают раствору отстояться до выхода всех пузырьков воздуха и разливают по чашкам. 13.9.11.