Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Последующую промывку фильтров проводят в перфорированной емкости, представляющей собой полиэтиленовую бутылку с отрезанным горлышком, имеющую множество отверстий по бокам и на дие (отверстия можно сделать горячим трехгранным напильником). 6. Дважды промывают фильтры в 5%-иой ТХУ и два или три раза в этаноле, последовательно перенося пер- !! ПЕРЕНОС ГЕНОВ форированную бутылку в стакан с соответствующим раствором. 7. Для высушивання бутылку с фильтрами помещают в сушильный шкаф, а затем измеряют радиоактивность каждого фильтра в сцинтилляциониом счетчике (равд. 16.4.3).
8. В каждой пробе вычитают фон и подсчитывают число распадов в минуту, приходящееся на 1 мл препарата ДНК; для этого нужно знать эффективность счетчика для используемой сцинтилляциониой жидкости (равд. 16.4.3). 9. Вычисляют концентрацию ДНК (в мкг/мл), зная удельную активность (в мкКН/мкг) суммарного меченого тимидина, добавленного в культуру, мол. % тимндина в ДНК, число распадов в 1 мин на 1 мл препарата ДНК и константу распадов в минуту для 1мкКн (2,2 10') 14Л.З.
Трансформация у Асте/ойас1ег са1соасеВсиз А. са/спасе/!сиз — грамотрицательный оксидазоотрицательный неподвижный кокк, компетентность которого развивается под действием различных условий культивирования, а трансформация не зависит от присутствия двухвалентных катионов 123). Трансформацию этой бактерии легко осуществить в лабораторных условиях. Савула и Кроуфорд (34) показали, что гены /ГрА и /ГрВ, кодирующие две субъединицы триптофансинтазы, тесно сцеплены и трансформируются совместно; они разработали метод отбора одинарных и двойных трансформантов на первичной селективной среде. Метод основан на том, что штаммы с мутацией /грА, образующие большие колонии на агаровой среде с 1О мкг/мл 1-триптофана илн 40 мкг/мл индола, дают маленькие колонии на среде, содержащей всего 5 мкг индола в 1 мл, Таким образом, трансформация реципиента с мутацией /грВ, растущего только в присутствии 10 мкг/мл 1.-триптофана, с помощью ДНК донора с мутацией /грА приводит к появлению клеток, которые при посеве на агаровую среду с 5 мкг/мл индола образуют и маленькие, и большие колонии.
Маленькие колонии возникают вследствие со. ЧАСТЬ ПЬ ГЕНЕТИКА вместной трансформации мутации (грА с аллелем 1грВ+ донора, в то время как большие колонии — вследствие трансформации только аллеля 1грВ+ донора. Штамл!ы Штаммы как донора, так и реципиента были выделены из штамма ВР413 — мутанта с недоразвитой капсулой, полученного из штамма ВР4 дикого типа А. са1соасеВсиз, способного к трансформации (231. Донорный штамм имеет мутацию 1грА28, а реципиентный — мутацию 1грВ13 (34). Эти штаммы растут при температуре от 30 до 35'С и хранятся при 4'С на око. щенном Е-агаре. Пересевы на свежую среду должны производиться каждые 2 мес.
Средь! А. са1соасейсиз можно культивировать на разнообразных полных средах, таких, как 1-бульон или 1-агар, бульон и агар Репаззау, сердечно-мозговой бульон илн агар. Можно также использовать различные минимальные среды, годится и среда !7В-Е. Работая с мутантами 1грВ и 1грА, для стимуляции роста прототрофных рекомбинантов и одновременного предотвра!ценна роста мутантов можно использовать кислотный гндролизат казеина, например казаминовые кислоты (0,5е/а), так как в процессе кислотного гидролиза трнптофан разрушается. Методы приготовления сред см, в равд. 14.4.
Выделение ДНК методом Мармура (29] ДНК донорного штамма 1грА выделяют по Мармуру (равд. 22.2.1) или одним из простых способов, описанных анже. Выделение ДНК методом Савулы и Кроуфорда (84) 1. Выращивают клетки-доноры с использованием аэрации при 30 — 35'С до ранней стационарной фазы в 1О мл 1-бульона (равд. 14.4.1). Аэрацию осуществляют, применяя либо пробулькивание пузырьков воздуха через 70 !Е ПЕРЕНОС ГЕНОВ среду в пробирках (пробирки диаметром 25 н высотой 200 мм, снабженные стеклянной палочкой с поперечником 4 — 5 мм; палочку облегает резиновая трубка, которая выходит через завпнчивающу!Ося крышку пробирки; пробирку подсоединяют к аквариумному насосу с соблюдением правил стерилизации продуваемого воздуха), либо встряхиванне на качалке в колбах, погруженных в водяную баню, 2.
Клетки осаждают центрифугированием и суспендируют в 2,4 мл солевого буфера с ЭДТА (0,15 М 1!(аС1, 0,1 М ЭДТА, рН 8,0). 3. Добавляют 100 мкл 6 % -ного додецилсульфата натрия и инкубнруют суспензию !О мнн при 37'С для обеспечения ливиса клеток. 4. Осветляют лизат добавлением 50 мкл 5 М КС1 и после охлаждения во льду центрифугируют 20 мин при 39000 и. 5. Нагревают надосадочную жидкость, содержащую ДНК, при 50 — 60'С в течение 5 мин, чтобы убить все оставшиеся клетки.
6. Проверяют стерильность препарата посевом пробы в чашку с Е-агаром (равд. 14.4.1), которую инкубируют ночь при 30 — 39'С. 7. Если нужно, осаждают ДНК добавлением двух объемов холодного зтанола и наматывают ее на стеклянную палочку с маленьким крючком на конце (равд. 22.2.1), Растворяют ДНК в цитратносолевом буфере. 8. Определяют концентрацию ДНК цветной пробой с дифениламином (равд. 22.4,3), так как в полученном препарате могут содержаться РНК и другие примеси, поглощающие в ультрафиолете.
9. Хранят препарат ДНК при 4'С. Выделение ДНК рпрои(енным методом Юни 1221 1. Отбирают петлей выросшую на скошенном агаре или на агаре в чашке бактериальную биомассу и суспендируют клетки в маленькой пробирке в 0,5 мл стерильного раствора, содержащего 0,15 М ИаС!, 0,015 М трехзамещенный лимоннокислый натрий и 0,05а/а-ный додецилсульфат натрия. 71 члсть нь гвнвтикх 2. Прогревают суспензию при 60 — 65'С в течение 1 ч.
3. Неочищенный лизат хранят при 4'С. Он сохраняет стабильность в отношении трансформирующей активности по крайней мере в течение года. Осуи1есгвление ерансформаиии 1. Выращивают реципиентный штамм 1грВ в ).-бульоне (равд. 14.4.1) в течение ночи при 35 'С, применяя аэрацию. (А. са1соасе((сиз может расти при любой температуре в интервале 30 — 37'С; несколько ускоренный рост наблюдается при 35'С.) 2. Разводят культуру в 10 раз свежим подогретым 1-бульоном и азрируют се либо пропусканием пузырьков воздуха, либо на качалке в течение 2 ч при 35 'С. 3. В каждую чашку с минимальным агаром ЧВ (равд.
14.4.6) (дополнснным 0,5% казаминовых кислот, 0,5% глюкозы и 5 мкг/мл ицдола) вносят 100 мкл компетентной культуры реципиента и различные количества препарата ДНК донора (возрастающие количества от 10 до 200 мкл, или 20 — 500 мкг), 4. Немедленно смешивают оба препарата и распределяют их равномерно по поверхности агара стеклянным шпателем, предварительно промытым в этаноле, фламбированным и охлажденным. 5. В качестве контроля наносят и равномерно распределя|от !00 мкл популяции клеток реципиента в чашку с селективной средой, чтобы убедиться в отсутствии ревертантов 1грВ~ или других посторонних бактерий. 6. Как дополнительный контроль наносят на агар и равномерно распределяют 100 мкл препарата ДНК донора в чашку с селективной средой, чтобы убедиться в отсутствии посторонних микроорганизмов. 7.
Добавляют 10 мкл ДНКазы с концентрацией 100 мкг/мл в 0,2 М МцС1~ к 100 мкл препарата донорной ДНК (находящейся в цитратносолевом буфере) примерно за 2 — 3 мин до смешивания на селективной среде со 100 мкл суспензии компетентных реципиентных клеток. Этот контроль должен подтвердить, что расщепление ДНК приводит к исчезновению колоний трансформаптов. 1Е ПЕРЕНОС ГЕНОВ 8.
Все чашки переворачивают и инкубируют ночь при ЗбьС или до тех пор, пока колонии не станут ясно различимыми. 9. Просматривают чашки и, не повреждая колоний, подсчитывают общее число маленьких и больших колоний в каждой чашке. 1О. Выделяют чистую культуру из нескольких маленьких колоний, чтобы определить, действительно ли свойства их клеток соответствуют фенотипам ожидаемых котрансформантов !грА23 !грВ+ (т.
е. они продолжают зависеть от триптофана или индола и образуют большие колонии на средах, содержащих 40 мкг/мл индола). Выделяют чистую культуру из больших колоний, чтобы определить, действительно ли их рост нс зависит от нндола или триптофана. Это делают следующим образом. а) Отбирают 10 — 20 отдельных колоний каждого типа (используя либо стерильные зубочистки, либо стерильные бактериальные иглы) в 1 — 2 мл соленого буфера с желатиной (СБЖ; равд. 14.4.7), находящегося в пробирках диаметром !3 н высотой !00 мм, или в микрокапельки СБЖ на стенках пластмассовой чашки Петри.
б) Высевают зги суспензии штрихом в чашки с селективной агаровой средой так же, как в случае получения отдельных колоний. Это делают с помощью стерильной иглы, если колонии суспендировали в очень маленьком объеме СБЖ, или с помощью стерильной бактериальной петли, забирая ею как можно больший объем суспеизии со стенки пробирки, если колонии суспеидировали в 1 — 2 мл СБЖ. Чашки с селективным агаром разделяют на 4 — 10 мелких секторов, чтобы иметь возможность очистить 4 †!О образцов в одной чашке. в) Инкубируют чашки при 35'С в течение 1 — 2 сут.
г) Отбирают в СБЖ обособленные колонии, происходящие нз отдельных трансформантов; полученные суспензии высевают штрихом на минимальный агар с добавкой 5 мкг/мл индола, 40 мкг/мл индола, 10 мкг/мл триптофана и на минимальный агар без добавок. Чашки инкубируют при 35 'С. 11. Анализируют результаты для того, чтобы определить, возрастает ли общее число трансформантов пропорционально количеству взятой в опыт ДНК донора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
