Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 17
Текст из файла (страница 17)
В качестве контроля инкубируют пробу при ЗО'С. 2. Трансдуктаиты должны быть невосприимчивы к фагу Х. Это определяют перекрещивающимся посевом. Около 50 мкл лизата фага Х с1857 равномерно полосой наносят ниже центра в чашку с агаром ЕМВО. Через 5 — !О мин, когда лнзат впитается в агар, наносят полосой взятую петлей чистую культуру трансдуктанта Оа1" таким образом, чтобы она пересекала фаговую полосу. Контролями для этого теста служат штаммы донора и реципиента. Чашки инкубируют при 30'С.
Рост неинфицированных контрольных бактерий в стороне от фаговой полосы определяют по окраске от белой до розовой в чашках с агаром ЕМВО. Чувствительность к фагу Х выявляют по ярко-красному окрашиванию выживших бактерий в месте пересечения фаговой полосы с полосой чувствительного к фагу штамма. Изменение цвета обусловлено продукцией или освобождением кислоты вследствие ливиса части бактерий. Таким образом, агар ЕМВΠ— очень тонко реагирующий индикатор на чувствительность бактерий к умеренным фагам, которые не лизируют все инфицированные клетки.
3. Трансдуктанты должны быть частично диплоидны и гетерозиготны, поскольку они имеют как ца1+-, так н М. ПЕРЕНОС ГЕНОВ да1--Гены. Это определяют следующим способом. Разводят культуру таким образом, чтобы при распределении 100 мкл по поверхности агара ЕМВ+Са! в чашке после иикубации при 30'С вырастало 100 †3 колоний. Если трансдуктаиты частично диплоидны и гетерозиготны, то приблизительно ! †колоний выглядят как отрицательные по сбраживанию и имеют окраску от белой до розовой, а остальные положительные по сбраживанию колонии окрашены в темно-фиолетовый или черный цвет.
Возникновение феиотипов ба! происходит вследствие рекомбинации, приводящей к гомозиготности по признаку йа1, исходно имеющемуся у реципиента. 4. Большинство трансдуктантов Са! Р, возникших при низкой множественности заражения, будут нести лишь геном Хда1-трансдуцирующего фага; некоторые из них можно проанализировать, проинкубировав культуру при 37'С, с тем чтобы выяснить, высвобождаются ли при этом инфекционные частицы фага !.. Это делают следующим образом: 1) разводят культуру выделенных трансдуктантов 1:!О в 1 — 2 мл супер-бульона в пробирках диаметром !3 и высотой 100 мм; 2) инкубируют пробирки при 37'С в течение 2 ч; 3) добавляют каплю СНС!з, чтобы убить выжившие бактерии; 4) наносят отобранный петлей лизат в чашки с агаром ЕМВО или лямбда-агаром и сверху наслаивают 2 мл мягкого лямбда-агара, к которому предварительно добавляют !00— 200 мкл культуры, находящейся в логарифмической фазе роста бактерии, чувствительной к фагу Х, и 5) чашки инкубируют в течение ночи при 37'С.
Скорее всего исследуемые Са!'-трансдуктанты будут содержать частицы фага Х с геномом Г!да! и окажутся не способными образовывать фаговые частицы, лизирующие индикаторный штамм, чувствительный к фагу Х. Это вызвано тем, что гены фага Х, необходимые для литической реакции, заменены генами да!~.
5. Большинство Са! Р-трансдуктаптов, образующихся при множественном заражении, являются двойными бактериями-лизогенами, содержащими как профаг дикого типа Х с1857, так и профаг с геномом Г!йа!. Инкубация культур этих траисдуктантов при 37 'С приводит к спонтанному лизису с высвобождением смеси приблизительно равного количества частиц фага Х с1857, которые ЧАСТЬ 111. ГЕНЕТИКА способны образовывать стерильные пятна, и фага А т(да1. Способность к образованию пятен в этих лизатах проверяют методом, описанным выше.
Такие лизаты имеют высокую концентрацию частиц А па1 и могут трансдуцировать с образованием типа Оа!" 1Π— 50% реципиентов с мутацией по гену да1. В этом можно убедиться повторной трансдукцией, проводя ее так, как описано выше (равд. 14.2.1), с той лишь разницей, что инфекционную смесь разводят (10-' — 10 ') перед посевом в чашки с агаром МЛ+Оа!. Полученные лизаты были названы траисдуцирующими с высокой частотой (НГТ) в противоположность лизатам, трансдуцирующим с низкой частотой (1ГТ), которые образуются при первоначальной индукции при 37'С донорного штамма лизогенной бактерии, содержащей профаг А с1857. Применение Специфическая трансдукция облегчает генетические исследования у бактерий, касающиеся, в частности, расположения и регуляции генов.
Для Е. сой существует множество фагов, подобно фагу Х включающихся в хромосому бактерии в разных местах и позволяющих осуществлять специфическую трансдукцию хромосомных маркеров. Очень важно при этом, какой используется донор-хозяин. Например, штамм 2 (табл. 14.1) имеет делецию в месте нормальной интеграции профага Х; в этом случае фаг Х включается с низкой частотой в другие, несвойственные для него места, разбросанные по всей хромосоме. Индукция таких лизогенных бактерий приводит к формированию трансдуцирующих фагов, несущих почти любой желаемый геи 135].
Этот подход может быть использован и для других фагов Е. со(1, осуществляющих специфическую трансдукцию, а также для фагов, размножающихся в других видах бактерий. Многие из методов, позволяющих реализовать эти подходы и другие возможности использования фагов, способных к специфической трансдукции, описаны Миллером 12). И.ПЕРЕНОС ГЕНОВ 14.2.2. Общая трансдукция (Е. сой — бактериофаг Р!) Штаммы бактерии и фага Бактериофаг Р! представляет собой вирус, осуществляющий общую трансдукцию на чрезвычайно широком круге хозяев.
Не представляет труда выделить мутант фага Р1, который с большой эффективностью размножается приблизительно на 70% штаммов Е. сой, полученных из клинического материала, а также мутанты, легко инфицирующие штаммы родов ЯЬ1дейа, Яа1гпопе1- 1а, ЕП1егоЬас1ег, К!ебз(ейа и СйгоЬас1ег [!7), Благодаря этому свойству, а также тому, что фаг Р! может трансдуцировать фрагменты донорной ДНК, по мол. массе доходящие до 60 10', этот трансдуцирующий фаг очень полезен. Однако по сравнению с другими часто используемыми колифагамн фаг Р! медленней адсорбируется на бактериях, образует очень маленькие стерильные пятна и дает лизаты, которые стабильны только при условии, что абсолютно лишены остатков бактериальных клеток. Фаг Р1 Ас [241, являющийся производным фага Р1, с высокой эффективностью заражает штамм Е.
сой К-12 и образует относительно прозрачные стерильные пятна, что облегчает его определение. Однако Р1 Ьс способен лизогеннзировать бактерию-хозяина. Фаг Р1 14 [8] представляет собой мутантную форму фага Р! Ьс с мутацией в гене репрессора С7, которая делает его не способным к лизогеннзации. Несмотря на то что для трансдукции фагом Р! могут быть использованы многие донорныс и реципиентные штаммы Е.
сой К-12, принципы работы с ним удобно показать на системе, позволяющей простую демонстрацию совместной трансдукции (котрансдукции). Для этого донорный штамм (штамм 7, табл, !4.1) должен иметь мутацию !ась, обусловливающую неспособность синтезировать р-галактозидазу и, следовательно, невозможность использования лактозы в качестве источника углерода. Реципиент (штамм 8, табл. 14.!) должен обладать генотипом 1асУ+ргоС, чтобы при отборе трансдуктантов по ргоС+ некоторые из них могли иметь наследуемую мутацию донора !ась, трансдуцирующуюся совместно с мута- ЧАСТЬ 1П.
ГЕНЕТИКА цией ртоС+. Эти два гена котрансдуцируются примерно в 30% случаев. Для описанного эксперимента подходит фаг Р! /гс независимо от того, способен он лизогенизировать реципиентный штамм нли нет. Среды Для выращивания бактерий, приготовления лизата и определения фага Р1 используют 1-бульон, (.-агар (1,2'/, агара) и мягкий Е-агар (0,65% агара), содержащий 2,5 мМ СаС!Р, для бактериальных проб — агар Репаззау и для отбора трансдуктантов — среду Ъ'В-Е, дополненную 1% лактозы, 0,4% двузамешенного янтарнокислого натрия и 50 мкг/мл трнфенилтетразолийхлорида. На последней среде трансдуктанты 1ас+ртоС» имеют белые колонии, а трансдуктанты 1асЯртоС+ способны расти благодаря наличию сукцината как источника углерода, образуя колонии красного цвета.
Цитрат-ион, находящийся в среде ЧВ-Е, связывает Са»", требуемый для адсорбции фага Р1, и поэтому заражение этим фагом бактерий на селективной среде сводится к минимуму. Методы приготовления сред см, в равд. 14.4. Определение титра фага 1. Добавляют 1 мл 12-час культуры (вырашенной в 1.-бульоне в отсутствие СаС!Р без принудительной аэрации; см. 1-й этап в «Осуществлении трансформации» в равд. 14.1.4) Р1-чувствительного штамма донора к 9 мл 1.-бульона, содержащего 2,5 мМ СаС4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
