Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 18
Текст из файла (страница 18)
2. Далее аэрацию культуры обеспечивают посредством пропускания пузырьков воздуха или встряхиванием при 3? 'С в течение 60 — 90 мин до тех пор, пока культура не достигнет титра, приблизительно равного 2 10' клетка/мл. 3. Пока культура растет, делают разведения (10 †', 10 ' и 10-') 1.-бульоном, содержащим 2,5 мМ СаС!Р, фаголизата Р1 14 (или Р1 йс), титр которого должен быть равен 10" ПОЕ/мл. 4. Аликвоты выращенной культуры Р!-чувствительного штамма объемом 1,9 мл разливают по пробиркам диаметром 13 и высотой 100 мм при 37'С.
92 Ри леРенос ГенОВ 5. После нескольких минут, требуемых для уравнения температуры, добавляют из каждого разведения фаголизата Р1 100 мкл и оставляют на 20 — 30 мин, чтобы произошла адсорбция фага на бактериальных клетках. 6. Вносят по 200 мкл полученной смеси в 2 мл мягкого 1.-агара и немедленно выливают на поверхность Е-агара, содержащего 2,5 мМ СаС1ь Через 5 мин чашки переворачивают и инкубируют при 37'С. Стерильные пятна становятся видимыми через 6 ч инкубации; их диаметр варьирует в пределах 0,5 — 1 мм.
Чашки с пробами на Р1 Е4 можно инкубировать перед подсчетом в течение ночи, а на Р1 йс — порядка 6 ч, так как в случае инкубации, продолжающейся всю ночь, из-за роста лизогенизированных клеток в центре чашки пятна становятся мутными и трудно различимыми. Титр фага равен числу пятен, умноженному на 100 и на величину, обратную соответствующему разведению. Приготовление лизата трансдуцирующего фага 1.
Выращивают нужный штамм бактериальиого донора, как это описано выше в «Определении титра фага» (этапы 1 и 2). 2. Фаголизат Р1 14 (или Р1 ле) разводят в (.-бульоне с 2,5 мМ СаС11 так, чтобы в 1 мл содержалось 6.10'— 8.10" ПОЕ, и добавляют по 100 мкл лизата к 1,9 мл культуры донора, находящейся в логарифмической фазе (в пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм) при 37'С. 3. Оставляют пробы на 20 — 30 мин для предварительной адсорбции фага Р1.
4. Из каждой пробы отбира1от 200 мкл смеси, добавляют к 2 мл мягкого 1.-асара +2,5 мМ СаС1, и немедленно разливают по поверхности 1.-агара+2,5 мМ СаСЬ в чашке. Таким способом готовят от пяти до восьми чашек. (На каждую чашку следует засевать от 6.10' до 8 1О' клеток донора, зараженных фагом Р! 1.4 или Р1 йс, при избытке незараженных бактерий.) Через 5 мин чашки переворачивают и иикубируют 6 ч при 37'С. 5.
Наливают на поверхность агара в каждую ча1пку 3 — 5 мл (.-бульона, содержащего 10 мМ МАЗО, (но не СаС11). С помощью стеклянного шпателя размельчают 93 ЧАСТЬ ПЬ ГЕНЕТИКА слой мягкого агара и собирают его в центрифужный стакан объемом 40 — 50 мл из полипропилена (или другого материала, устойчивого к СНС)з). Добавляют примерно 100 мкл СНС!з на каждые 4 мл лизата, плотно закрывают центрифужный стакан и интенсивно перемешивают содержимое в течение 1 — 2 мин на миксере типа Чог1ех. Стакан оставляют на 2 ч при комнатной температуре или на ночь в холодильнике, чтобы фаг Р1 успел продиффундировать в водную фазу. Время от времени перемешиванне можно повторять. 6. Неочищенный лизат центрифугируют при 5000— 6000 и в течение 10 — 15 мнн и осторожно декантируют надосадочную жидкость в колбу илн пробирку с завинчнвающейся крышкой. Добавляют к полученному лизату несколько капель СНС11 и энергично встряхивают.
Хранят лизат при 4'С. На следующий день определяют титр лизата, как это было описано ранее, и проверяют его стерильность посевом небольшого количества в чашку с 1.-агаром или агаром Репаззау. Такие лизаты относительно стабильны, но за год при температуре хранения 4'С их титр может упасть на 1 — 2 порядка. Полной стабильности фаголнзата Р1 достигают фракционнрованием в градиенте СзС! с последующим удалением СзС! диализом против 1.-бульона+10 мМ МЕЗО«!81.
Создание бактерий, лизогенных по фазу Р11гс Когда эксперименты по трансдукции проводят с целью количественной оценки частоты генов в клетках- донорах, котрансдукции и др., целесообразно использовать реципиентные штаммы, лизогенные по фагу Р! йс. В тех же случаях, когда трансдукцню применяют для создания 1птаммов, это нежелательно. Лизогенные реципиентные штаммы создают следующим образом. 1. Выращивают нужный реципиентный штамм, как описано выше в «Определении титра фага» (этапы 1 и 2).
2. Вносят по 0,9 мл культуры в пробирки размером 1ЗХ!00 мм н оставляют прн ЗО'С на 5 мин для уравнивания температуры. гс ПЕРЕКОС ГЕНОВ 3. Добавляют 0,1 мл фаголизата Р1 йс с таким расчетом, чтобы на одну бактерию приходилось 3 ПОЕ. Если лизат не разводился по крайней мере в 10 раз, нужно быть уверенным в отсутствии следов СНС!з, что необходимо для предотврап!ения гибели клеток реципиента. 4. Инкубиру4от при 30'С 2 — 3 ч. При инфекции фагом Р1 лизогеиизации благоприятствует пониженная температура (20 — 30'С), а литической реакции — высокая температура (37 — 42'С). 5. Для получения отдельных колоний делают посев культуры штрихом в чашку с агаром Репаззау или 1-агаром илн обычный посев соответствующего разведения. 6.
Отбирагот и очищают 10 хорошо обособленных колоний (нерастекающихся и с правильными гладкими краями )на Е-агаре, применяя общие методы, описанные в 10-м этапе «Осуществления трансформации» в равд. 14.1.3. ?. Отбирают хорошо обособленную колонию каждого нз 10 изолятов в пробирку диаметром 13 и высотой 100 мм, содер>кашу!о 2 мл 1-бульона+1мМ цитрат (без СаС!з). Пронумерованные 10 культур инкубнруют при 42'С 4 — 6 ч до получения концентрации примерно 2.10' клетка/мл. При 42'С увеличивается скорость спонтанной индукции бактерий, лизогенных по фагу Р1, а благодаря отсутствию ионов Са'+ фаг Р1, высвобождаемый вследствие спонтанной индукции, накапливается.
8. Проверяют, действительно ли предполагаемые бактерии, лизогенные по фагу Р1, высвободилн его во время роста при 42 'С. а) Вносят по 1 мл каждой из десяти культур и 1 мл культуры исходного Р1-чувствительного штамма (в качестве контроля) в ппонумероаанные пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм при 42 С. б) В каждую пробирку добавляют каплю СНС14, встряхивают н продолжают инкубнровать в течение 15 — 20 мнн. а) Делают последовательные десятикратные разведения фаголнзата Р1 Ас от 10 ' до 10-'.
г) Добавляют 200 мкл культуры Р!-чувствительного штамма, выращенного в 1-булоне+2,5 мМ СаС1, и находящегося в логарифмической фазе, к 2 мл расплавленного мягкого Е-агара+2,5 мМ СаС1,. Выливают агар в чашку с агаром ЕМВО+2,5 мМ СаС14 и дают слою мягкого агара затвердеть. 95 часть и!. Гвнвтнкд д) Наносят максимально наполненной петлей на поверхность мягкого агара одной чашки с ЕМВО пробы нз одиннадцати обработанных хлороформом культур и восьми последовательных разведений фага Р1. Чтобы высвободить все содержимое, взятое петлей, ее краем прикасаются к поверхностц агара.
Крышку чашки Петри оставляют приоткрытой до тех пор, пока нанесенный материал не впитается в мягкий агар. На дне чашки отмечают положение всех нанесенных проб. е) Лучше всего инкубировать чашку с ЕМВО неперевернутой при З7 нли 42 'С в течение ночи. Области ливиса (сплошного или в виде пятен) должны наблюдаться для каждого обработанного хлороформом экстракта, приготовленного из клеток, лизогеиных по фагу Р1, означая тем самым, что во время роста при 32'С высвободилось достаточное количество фага Р1.
Нанесения разведений лизата Р1 дают представление о чувствительности метода. 9. Проверяют, устойчивы ли к фагу Р1 клетки, лизогенные по этому фагу. а) Наносят 60 — ! 00 мкл фаголизата Р1 Е4 (содержащего 1О" ПОЕ)мл) ниже центра чашки с агаром ЕМВО+2,6 мМ СаС1ь Оставляют крышку приоткрытой, пока нанесенная полоса не подсохнет. Размечают на дне чашки направление и расположение всех полос. б) Набирая каждый раз по полной петле, делают посев в виде полос, пересекающих полосу лизата всех десяти культур, как пред. полагают лнзогенных по фагу Р1, и культуры жизнеспособного Р1-чувствительного исходного штамма. в) Дают полосам подсохнуть.
Переворачивают чашки и инкубируют их при 37'С в течение ночи. Выделенные бактерии, устойчивые к фагу Р1 1.4 и высвобождающие фаг Р1 )гс во время роста при 42'С, можно использовать как источник клеток, лизогенных по фагу Р1 лс. Клетки, лизогенные по фагу Р1, проявляют нестабильность, по-видимому, из-за того что профаг Р1 существует в клетке в виде плазмиды, которая иногда теряется. Поэтому после ряда пересевов культур, лизогеиных по фагу Р1, может понадобиться их повторное выделение, для которого используют процедуры и проверки, перечисленные выше. Рост лизогенных бактерий в присутствии 2,5 мМ СаС1т при 37'С также приводит к спонтанному высвобождению фага Р1, инфицирующего нелизогенную часть культуры, клетки которой либо лизируются, либо повторно становятся лизогенными.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
