Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Если к нему добавить Тс, Ст или 8ш и Иа! (равд, 14,4, табл. 14.4), то он годится для отбора трансконъюгантов, содержащих )х-плазмиды. Для отбора трансконъюгантов типа 1.ас+Иа)' можно применять агар, приготовленный на среде 1/В-Е и дополненный 0,5% лактозы, пролином и налидиксовой кислотой в концентрации 50 мкг/мл. Методы приготовления сред см. в равд. 14.4, Метод переноса плазмид Р' 1. В пробирки диаметром 16 и высотой 125 (или 150) мм, содержащие по 5 мл бульона Репаззау, вносят полные петли выращенной на скошенном агаре биомассы каждого типа клеток и инкубируют в течение ночи при 37'С без аэрации. 2. Разводят выросшие культуры 1:100 или 1;200 в 10 и 20 мл предварительно подогретого бульона Репаззау.
Культуры аэрируют либо пропусканием пузырьков воздуха, либо встряхиванием и выращивают до концентрации -2 10' клетка/мл. Для оптимальной экспрессии фенотипа донора за 30 мин до начала конъюгации аэрацию лучше прекратить, так как рост без аэрации благоприятствует образованию максимального числа и максимальной длины половых ворсинок, детерминируемых М.
ПЕГЕИОС ГЕНОВ фактором Г. Правда, это может относиться не ко всем типам конъюгативных плазмид. 3. В водяную баню с температурой 37'С помещают либо плоскодонные микроколбы Фернбаха на 125 мл, либо 250-мл колбы Эрленмейера, снабженные утяжеляющими свинцовыми кольцами вокруг горлышка, так чтобы уровень воды в бане был немного ниже пробок колб. Свинцовые кольца можно вырезать в форме пончиков из свинцового листа толщиной 6 — 8 мм. Если нет свинцовых колец, закрепляют колбы таким образом, чтобы они не всплывали и были бы погружены в воду, Погружение колб важно в том случае, когда температура культуры во время конъюгации должна поддерживаться на уровне 37 'С.
4. В колбу наливают 9 мл культуры реципиента, чтобы она приняла температуру бани, и определяют ее титр посевом разведения 10 ', равномерно распределяя его по поверхности агара Репаззау в чашках. Делают так>ке посев аликвот неразведенной реципиентной культуры объемом 100 мкл на селективную агаровую среду, чтобы убедиться в том, что культура свободна от постороннего материала и содержит неболыпое количество ревертантов (или их совсем нет). 5. Через 5 мин добавляют в колбу 1 мл культуры донора н легким вращательным движением смешивают клетки донора и реципиента. Титруют культуру донора и высевают 100 мкл ее на селективную среду.
Обращают внимание на то, чтобы общий объем находящейся в колбе жидкости, равный 10 мл, имел высоту слоя 2 мм— это обеспечивает достаточную диффузию кислорода к конъюгирующим клеткам и устраняет необходимость аэрации встряхиванием. Хотя обычно в подобных опытах используют избыток реципиентных клеток, можно брать достаточно широкий интервал отношений клеток донора и реципиента — от 1: 20 до 1:1; требуемые отношения получают варьированием объема и (или) плотностей добавляемых в колбу культур донора и реципиента. 6.
Через 5-, 1О- или 15-мин интервалы в течение 1 ч смесь донорных и реципиентных клеток разводят и высевают аликвоты объемом 100 мкл (50 мкл на чашку) на селективну1о агаровую среду. При длительности 107 ЧАСТЬ П!. ГЕНЕТИКА конъюгации до 30 мин делают конечные разведения 10 ' — 10-', при более продолжительной коныогации— разведения 10 ' — 10-'. Чашки переворачивают и инкубируют при 37'С.
Культуры донора и реципиента, выращенные на комплексных богатых средах, образуют трансконъюганты с большей частотой, чем выращенные на синтетических средах. Однако селекция на синтетических средах траисконъюгантов, которые являются потомками клеток, выращенных и конъюгировавших в бульоне, вследствие худших условий роста приводит к выявлению меньшего числа трапсконыогантов по сравнению с реально образовавшимся. Эту трудность можно преодолеть добавлением 10%-ного (объем/объем) бульона Репаззау к среде СБЖ, используемой для разведения смесей конъюгирующих бактерий, так как при добавлении к селективной минимальной атаровой среде небольшого количества бульона способны образовывать колонии все трансконъюганты типа 1.ас~Ха1'.
Частоту образования трансконъюгантов для каждого времени прерывания процесса конъюгацпи вычисляют делением титра трансконъюгантов в 1 мл смеси на титр донорных клеток в смеси в начале процесса. Метод переноса й-плаз,шад Этапы с 1-го по 5-й те же, что описаны выше для переноса Р'-плазмид. Если б-й этап проводить, как описано выше, то трансконъюганты типов Тс"5)а!' и Сш"5)а!' будут выявляться с большей частотой, чем трансконьюганты типа Бш'Иа!', особенно при раннем прерывании процесса, а частоты, определенные для всех типов трансконъюгантов, будут ниже тех, которые реально имеют место. Это вызвано тем, что: 1) для экспрессии устойчивости к препаратам, обусловленной К-плазмидами, требуется, чтобы транскрипция и трансляция генов ц-плазмид в клетке-реципиенте осуществились до воздействия препаратов; 2) тетрацнклин и хлорамфеникол являются бактериостатиками, и поэтому экспрессия устойчивости к этим препаратам может медленно развиваться даже в их присутствии; в то же время стрептомицин бактсрициден и вызывает гибель всех трансконь- !4.
ПЕРЕНОС ГЕНОВ !огантов, которые ещс не проявили устойчивости к нему. Эти трудности, касающиеся фенотипической экспрессии, возрастают еще больше при работе с К-плазмидами, переносящими устойчивость к ампицнллнну или канамицину. Чтобы избежать их и добиться точности в измерении скорости и частоты переноса К-плазмид н каждый из моментов прерывания конъюгации, проводят следующий эксперимент. 100 мкл смеси коиъюгирующих клеток и 0,9 мл бульона Репаезау, содержащего 50 мкг/мл налидиксовой кислоты, вносят в пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм при 37'С. Оставляют пробирки на 20— 30 мин при 37'С, а затем разводят пробы и делают посев на селективные среды.
Чтобы убедиться в том, что гены, ответственные за различные типы устойчивости к лекарственным препаратам, действительно передаются одной и той же плазмидой, отбирают около 10 колоний каждого типа трансконъюгантов стерильными зубочистками и высевают нх на другие селектнвные среды. Применение Вышеописанные методики могут использоваться для изучения конъюгационного переноса генов, которые ответственны за кодирование множества признаков, определяемых плазмндамн. Конечно, выявление переноса плазмид Со1 [31 и плазмид, обусловливающих такие признаки, как продукция антигенов и энтеротоксинов [16~, требует применения специальных методик, так как прямой отбор по этим признакам невозможен.
Некоторые коныогативные плазмнды способны включаться в бактериальную хромосому с образованием доноров типа Н1г и при исключении из хромосомы могут захватывать часть хромосомной генетической информации, превращаясь в плазмиды типов К', Со1' илн Г'. Такие плазмиды могут использоваться для изучения отношений доминантности — рецессивности, комплементарности между аллелямн, а также различных аспектов регуляции генов. Их можно применять и для конструирования штаммов [2[. Эти плазмиды имеют гомологнчные с хромосомой участки и их можно применять вместо доноров Н1г 109 ЧАСТЬ Н1. ГЕНЕТИКА для увеличения подвижности и переноса хромосомных генов в определенном направлении и определенной последовательности (181. Это особенно полезно в связи с тем, что плазмиды К', Сор и Г' способны активировать хромосомы штаммов (или видов) бактерий, для которых не выделены доноры типа Н1г и которые близкородственны к штамму, из которого были получены плазмиды К; Со!' или Р'.
14.3.2. Хромосомный перенос (в Е, соВ Р- от Е. соВ Н1г) Шгаммы бакгерай У Е. со(1 выделено множество штаммов типа Н1г с различными точками начала переноса и различными направлениями хромосомного переноса (13, 27). Выбор штамма Н1г, таким образом, зависит от участка бактериальной хромосомы, который собираются изучать в отношении картирования генетических покусов. Новые Н1г-доноры могут быть легко выделены на различном генетическом фоне с использованием либо модифицированного флуктуационного теста со штаммом Р+ 16), либо интегративной супрессии в штамме Р+ или К+, имеющем мутацию йааА(ТЕ) (301. Методы осуществления скрещиваний типа Н(ТХР- можно проиллюстрировать, используя какой-либо Н1г-штамм, например прототрофный штамм 12 (табл. 14.1), который передает свою хромосому 0-(лг (еи ргоА !ас...
ругВ Г и чувствителен к налидиксовой кислоте и стрептомицину, и какой-нибудь штамм Р, например штамм 14 (табл. 14.1), с мутациями, обусловлпвающими ауксотрофность по лейцину, проливу, аденину, триптофану и тиамнну и устойчивость к налидиксовой кислоте и стрептомицину. У штамма 14 имеются и другие мутации, и наследование их аллелей дикого типа будет происходить как наследование маркеров, по которым не ведется отбор. Штамм 13 (табл. 14.1) несет меньше мутаций, чем штамм 14; он более удобен для проверки стабильности Н1г-фенотипа в штамме 12. ЬЬ ПЕРЕНОС ГЕНОВ Среды Как 1-бульон, так и бульон Репаввау обеспечивают оптимальный рост и максимальную экспрессию донор- ного и реципиентного фенотипов. Для определения титра культур донора и реципиента можно использовать агар Репаззау (с добавкой 8 г ХаС! на 1 л), а для отбора траисконъюгантов — соответствующим образом дополненную агаровую среду УВ-Е.
Например, трансконьюганты типа !.еи+Иа!" при скрещивании штаммов 12 и 14 можно отобрать на среде, содержащей 0,5'/ь глюкозы, а также пролин, аденин, триптофан, тиамин и налидиксовую кислоту (концентрации добавок см. в табл. 14.4 и 14.5). Для разведения можно брать солевой буфер с желатиной (СБЖ), который дополняют до !0% (объемтобъем) бульоном в том случае, когда смесь конъюгирующих клеток, находящуюся в комплексной среде, разводят перед посевом на синтетическую среду. Это небольшое количество бульона обеспечивает питательные вещества для осуществления рекомбинации, равно как и для фенотипической экспрессии признаков донора, и способствует максимальному выходу трансконъюгантов. Методы приготовления сред см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
