Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 22
Текст из файла (страница 22)
в равд. 14.4, Лроверка стабильности фенотипа Н1г Поскольку доноры Н1г возникают в результате встраивания конъюгативной плазмиды в бактериальную хромосому, они могут возвращаться к состоянию, прн котором эта плазмида вновь оказывается в цитоплазме. Поэтому, перед тем как использовать данный штамм в экспериментах по конъюгации, важно убедиться в том, что ббльшая часть клеток популяции Н1г действительно обладает фенотнпом Н1г. Это можно сделать как методом перепечатывания с чашки на чашку (метод отпечатков), так и методом отбора и посева штрихом. Перепечатывание с чашки на чашку 1.
Культуру Н1г разводят так, чтобы при высеве на агар Репаээау на одной чашке выросло 100 хорошо отделенных друг от друга колоний. Инкубируют 12 — 16 ч при 37'С. 111 ЧАСТЬ ПЬ ГЕНЕТИКА 2. Наносят 50 — 100 мкл выращенной в бульоне находящейся в логарифмической фазе культуры Р— штамма 13 (табл.
14.1) на поверхность агара, приготовленного на минимальной селективной среде для отбора трансконъюгантов типа (.еп+5(г". 3. Перепечатывают колонии Н1г-культуры в чашку с минимальным агаром и нанесенными на него клетками штамма Р . Фиксируют взаимную ориентацию и расположение колоний с помощью специальных пометок на дне исходной чашки и чашки-копии, Чашки инкубируют 24 — 48 ч при 37'С. 4.
В случае каждой колонии культуры Н1г, сохранивгпей Н1г-фенотип, должны быть видны сливающиеся пятна роста рекомбииантов; в случае колонии культуры Н1г, претерпевшей обратную мутацию и вернувшейся к состоянию Р+, будут видны только О, 1 или 2 рекомбинантные колонии. 5. Если в культуре достаточно много ревертантов типа Рь, из исходной чашки с агаром Репаззау можно отобрать колонню, имеюшую фенотип Н1г.
Метод отбора и посева штрихом 1. Делают посев Н1г-культуры для получения отдельных колоний в чашке с агаром Репаззау. 2. Отбирают 10 — 20 колоний в отдельные пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм, содержащие по 2 мл бульона. 3. Инкубируют культуры при 37'С в течение 4 — 5 ч, пока их плотность не достигнет 2 1О' — 5 10' клетка/мл.
В качестве контроля вырашивают культуры штаммов типа Р и Рч, например штаммы 5 и 7 (табл. 14.1). 4. Наносят штрихом 50 — 100 мкл вырашенной в бульоне находящейся в логарифмической фазе культуры Р- штамма 13 ниже центра чашки с агаром, приготовленным на минимальной среде, селективной по отношению к трансконъюгантам типа ).епь5(г', Крышку чашки оставляют приоткрытоя до тех пор, пока штрих не подсохнет. (При желании на одной чашке можно разместить два штриха.) 5.
Сразу же наносят штрихи петлями, полными клеток Н1Г, Р- и Р так, чтобы эти штрихи пересекали штрих Р- (соблюдая осторожность, чтобы не коснуться 112 !Е ПЕРЕНОС ГЕНОВ петлей стенок пробирки, что приведет к потере материала и разбросу результатов). Штрихам дают подсохнуть и инкубируют чашку при 37'С в течение 24 — 48 ч. 6, Штрих культуры, состоящей преимущественно из клеток с фенотипом Н1г, даст в месте пересечения двух штрихов сплошной рост трансконъюгантов, в то время как штрих культуры, состоящей в основном из Р4.-клеток, даст в месте пересечения лишь 5 — 10 обособленных колоний трансконъюгантов. При пересечении штрихов культур Р- и Р, понятно, трансконъюганты вообще не выявляются.
Оба приведенных метода основаны на том, что клетки донора способны передавать свои хромосомы в присутствии стрептомицина (с несколько сниженной частотой), хотя в конечном итоге они погибают от стрептомнцина на минимальном селсктивном агаре.
Налидиксовую кислоту нельзя использовать в этой системе для негативного отбора против клеток донора, так как она вызывает немедленное прекращение переноса генетического материала донорами типа Ма!', Осуществление прерь4ваемой конъюгации Если необходимо, используют очищенный повторным выделением штамм Н1г и штамм Р-.
Проводят операции, описанные в этапах 1 — б в «Методе переноса плазмид Р'» (равд. 14.3.1), с той разницей, что применяют минимальный агар, селективный по отношению к трансконъюгантам типов 1.ец+Ха!', Рго+14а!', Аде+Ха!', и методы разведения и посева, которые заключаются в следующем. 1. Через соответствующие интервалы времени (каждые 2, 3, 5 или 10 мин; для более частого отбора проб требуются два человека) 100 мкл смеси конъюгирующих клеток и 0,9 мл СБЖ, содержащего 50 мкг/мл налидиксовой кислоты, вносят в пробирки размером !ЗА!00 мм при 37'С. 2. Инкубируют эти разведения (1Π— ') при 37'С в течение 30 — 40 мин, учитывая в момент отбора смеси, что за счет последующих разведений и посева время инкубации увеличивается примерно на 30 с. !!3 ЧАСТЬ 1и ГЕНЕТИКА Таблица 14.2. Конечные разведения для посева, используемые для выявления трансконъюгантов различных классов при конъюгацин* типа Н1ГХГ— Класс отбираемых трансконъюгантов Время прерывания коныогацнв, мнн Ма! б 1О ь 10 в !О з 10 в 10 10 з 15 !О з 10 а 10 з 10-з Ю-з 1О-а !О-з ! О-а 20 1О з !О-з 35 10ч !О' 10-44 1О 4 40 45 50 !О 4 55 !О ' По результатам, ожидаемым в том случае, если рост и коиьюгация ютаимов !т н 14 (табл.
14.п осуществляются в оптимальных условиях. Посев ие обязателен, так как для этого времени прерывания появление транскоиъюгантов ае ожидается, Титр траисконъюгантов должен приближаться к максимальной ожидаемой частоте. Для некоторых илн всех последующих времен прерывания коньюгации посевы моитно ие делать, 3. Для каждого времени прерывания конъюгации высевают либо по 50 мкл смеси в две чашки с селективным агаром, либо 100 мкл в одну чашку. В табл. 14.2 приведены приблизительные величины окончательных разведений, высеваемых на каждый селективный агар, для разных значений времени прерывания спаривания.
Зги величины соответствуют случаю, когда отношение числа клеток донора и реципиента равно 1: 1О, суммарная плотность смеси составляет 2 10' клетка/мл, используется чистая Н1г-культура, а условия для проявления фенотипа Н1г н для переноса Н1г-хромосом являются оптим альпы ми. 10 з 10-' 10-з 10-4 Ш-з 10-а 10-4 1О-ь 1О 4 !О 'е 10 4 10-ь 10 4 10-4 1О 4 !О ' 10-4 10-ь Юа !О' !0-4 !О-' 10 з 10 а 10ь 10з !Оз 104 !О-з 10-4 Ш- 10- 1О-а Ш-ьа !О' 10' !О 4 1О ь !0-4 10-ь 10-» 10-' 1Оз 10з 10-з 1О з 10-з Я-4 10з 104 Из !04 10 а !0» и.
пвгвнос гамов 4. Для определения титров чашки с агаром Репаззау инкубируют в течение ночи при 37'С. Если штамм Н1г перед использованием не подвергался очистке повторным выделением, фракцию клеток Н1г можно определить на чашках с агаром Репаззау одним из методов, описанных выше в «Определении стабильности фенотипа Н1г». 5. Инкубируют чашки с минимальным селективным агаром двое суток при 37'С. Колонии при подсчете не разрушают, а чашки оставляют, поскольку их можно использовать для определения наследования маркеров, по которым не велся отбор. 6. Рассчитывают частоты появления трансконъюгантов путем деления титра трансконъюгантов каждого типа и для каждого значения времени прерывания на титр клеток Н1г в смеси в начале конъюгации. Полученные данные можно использовать для построения графика, по которому определяют время поступления с хромосомой каждого из отбираемых Н1т-маркеров.
Анализ трансконъюгантов на наследование признаков, по которым отбор не производился Иногда невозможно произвести отбор на наследование некоторых маркеров донора, или это трудно осуществить из-за большого числа маркеров, наследуемых в каждом конкретном случае. В связи с этим для оценки порядка расположения генетических локусов часто проводят более традиционный рекомбинационный анализ. Обычно это делают так: иглой или зубочисткой отбирают 100 — 200 колоний данного типа трансконъюгантов, клетки суспендируют в СБЖ и высевают штрихом на ту же селектнвную среду, чтобы получить очищенные обособленные колонии. Эти колонии можно затем нарастить в виде культур и использовать их для проверки генотипов путем посева штрихом на соответствующие среды или в виде пятна на подходящую агаровую среду с последующим анализом методом отпечатков, В последнем случае в исходной чашке должна находиться среда, селективная по отношению к фенотипу трансконъюганта, а среда в каждой чашке-копии должна помимо этой селективиости обладать селективными свойствами в отно- ЧАСТЬ ПЬ ГЕНЕТИКА шенин тех или иных способностей или потребностей штамма в питательных веществах.
Заранее ясно, что при таком подходе иногда не будет четких результатов, потому что порой не удается полностью очистить отбираемый тип трансконъюганта от родительских форм, существовавших до нанесения в исходную чашку, Поскольку перенос хромосом доноров Н1г-типа прерывается спонтанно, для четкого определения последовательности генов рекомбинантным анализом нужно, чтобы рекомбинанты, несущие заведомо известные маркеры, были протестированы на наследование близлежащих перенесенных маркеров. Так, в случае скрещивания штаммов 12 и 14 (табл. 14.1) отбирают 200 — 400 трансконъюгантов типа Тгр+5)а!", очищают их и тестируют на наличие маркеров Н1г: ага+, 1еи+, 1опА, ргоА+, 1ас'-, гзх+, ригЕ.ь и да1КГ. Это делают следующим образом: 1.
Культуры очищенных трансконъюгантов типа Тгр На!' высевают в виде точек (50 — 100) в чашку на минимальный агар, селективный по отношению к этому типу. Инкубируют в течение ночи при 37'С и последовательно перепечатывают в чашки с минимальным агаром, селективным по отношению к трансконъюгантам типов Ага"Тгр Ма!", (.еп+Тгр+Ха!', Рго«Тгр+Ыа!", 1.ас+Тгр+На!", Абе+Тгр+5(а!', ба!+ТгрьНа!', Последняя чашка представляет собой контроль, позволяющий убедиться в том, что клетки были действительно перенесены при перепечатывании в каждую из чашек. 2. Проверку устойчивости или чувствительности к фагам Т5 (ГопА) и Тб ((зх) точнее всего проводить посевом штрихов бульонных культур очищенных трансконъюгантов и пересекающихся с ними штрихов соответствующего фага в чашки со средой ЕМВО (см. 2-й этап в «Характеристике свойств трансдуктантов», равд.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
