Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 26
Текст из файла (страница 26)
6. Добавляют к суспензни 0,4 мл лизоцима (10 мг/мл в 0,25 М трисе, рН 8,0). Стакан оставляют во льду на 20 мин. 7. К клеточной суспензии добавляют 0,8 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0. 8. Клетки лизируют добавлением 4,4 мл тритоновой литической смеси (разд. 15.3.1) и аккуратно перемешивают. 9.
Инкубируют смесь в центрифужном стакане при 65'С в течение 20 мин. 10. Обломки клеток удаляют центрифугированием прн 27200 д в течение 40 мин (в роторе $5-34 на центрифуге Яогча!!). 11. К надосадочной жидкости добавляют раствор 5)аС! до конечной концентрации 0,5 М и полиэтнленгликоль (с мол. массой от 1000 до 6000) до конечной концентрации 10%, используя исходные растворы 5 М ЫаС! и 40%-ного полиэтиленгликоля. 12.
Оставляют смесь в центрнфужном стакане на ночь при 4'С. 13. Осаждают сформировавшийся осадок центрифугнрованием при 3000 д в течение 10 мин (в роторе 55-34 на центрифуге $огча11) и ресуспендируют его в 1 — 2 мл 0,25 М ЫаС!, содержащего 0,001 М ЭДТА н 0,1 М трис-НС!, рН 8,0. 14. Осаждают ДНК добавлением двух объемов 95'!!е. ного этанола прн — 20'С и оставляют на ночь при — 20 'С. 15.!.3.
Выделение с помощью додецнлсульфата натрия Описываемый метод, разработанный Герри и др. 131, представляет собой модификацию метода Хнрта 161. Метод дает хорошие результаты для бактерий, которые лизируются детергентом додецилсульфатом наг. И2 м пллзмиды рия (ДСН). Он основан на преимущественном осажде.
нии этим детергентом в присутствии хлористого натрия высокомолекулярной хромосомной ДНК. 1, В 100-мл колбу с исследуемым бактериальным штаммом вносят 30 мл сердечно-мозгового бульона (Р((со) и вырашивают культуру в течение ночи на качалке в водяной бане при 37'С. 2. Клетки осаждают центрифугированием при 12100 и в течение 10 мнн при 4'С. Осадок ресуспенднруют в 1,5 мл 25%-ной сахарозы, 0,05 М гриса и 0,001 М ЭДТА, рН 8,0. 3. К клеточной суспензии добавляют 0,2 мл раствора лизоцнма (10 мггмл лизоцима в 0,25 М трнсе, рН 8,0) и осторожно перемешивают. Оставляют центрифужный стакан во льду на 15 мин. 4. Добавляют 0,1 мл 0,25 М ЭДТА, рН 8,0, осторожно перемешивают и вновь ставят стакан в лед на 10 мпн.
5. Добавляют 0,1 мл 207~-ного раствора ДСН. Суспензию осторожно перемешивают и оставляют во льду на 10 мин. В течение этого времени клетки лнзир ются, и раствор становится вязким. б. Осаждают хромосомную ДНК добавлением 3 М г(аС! до конечной концентрации 1 М (обычно добавляют 0,9 мл 3 М ЫаС1). Оставляют стакан во льду по крайней мере на 2 ч, чтобы полностью сформировался осадок. Часто удобным оказывается оставлять стакан на ночь в холодильнике. 7. Осаждают хромосомную ДНК и все клеточные обломки центрифугированием в течение 30 мин при 17000 об/мин и температуре 4'С, отделяют надосадочную жидкость (обогашенную плазмидной ДНК), вносят ее в 15-мл пробирку из корекса.
8. Удаляют РНК добавлением одного объема дистиллированной воды и 4 мкл растворенной в 0,15 М ХаС! рибонуклеазы с концентрацией 5 мг/мл (перед использованием раствор рибонуклеазы выдерживают 10 мип при 100 'С, чтобы пнактивировать дезоксирибонуклеазы). Пробирку инкубнруют дополнительно 1 ч при 37'С. 9. Для депротеинизации смеси добавляют равный объем насыщенного трисом фенола, Смесь энергично встряхивают и затем центрифугируют в течение 20 мин !33 ЧАСТЬ !П ГЕНЕТИКА при 20'С и скорости вращения ротора 5000 об/мин. Отбирают водную (верхнюю) фазу, содержащую ДНК, и повторяют всю процедуру еще раз. 10. Переносят водную фазу в 30-мл пробирку из корекса и добавляют к ней 3 М ацетат натрия (обычно -0,6 мл) до конечной концентрации 0,3 М.
11. Добавляют 2 объема холодного ( — 20'С) 95О7оного этанола. Хорошо перемешивают и оставляют на ночь прн †20 'С. 12. Выпавшую в осадок ДНК осаждают центрнфугированием при 12100 д в течение 20 мин при — 1О'С. Осторомсно декантнруют этанол и растворяют осадок ДНК в 0,2 мл 6 мМ триса, рН 7,5.
Полученную ДНК можно охарактеризовать электрофорезом в геле, центрифугированием в градиенте плотности или определением гомологичных последовательностей. Этн методы детально описаны в равд. 15.3. 15.!.4. Выделение с помощью лизостафнна Приводимая ниже методика успешно применяется для получения плазмид из грамположительных бактерий, а также нз тех грамотрицательнь!х бактерий, которые не лизируются тритоном Х-100 и ДСН. 1. Клетки выращивают до середины логарифмической фазы роста в 30 мл сердечно-мозгового бульона в колбе на качалке. Культуру центрнфугируют н осадок суспендируют в 1,5 мл 0,0075 М ЫаС1, 0,05 М ЭДТА, рн 7,0. 2. Добавляют лизостафин (8)рта С)!еш(са! Со., 51. ).оп(з МО 63178) до конечной концентрации 15 мкг7мл, (Для 81арйу1ососсиз ерЫегтЫ!з концентрацию этого фермента следует удвоить.) Инкубируют суспензию в течение 15 мин при 37 'С в условиях слабого покачивания, после чего оставляют колбу во льду.
3. Добавляют 1,5 объема смеси, содержащей 0,4тзную дезоксихолевую кислоту, !А/а-ный Вг!1'-58 н 0,3 М ЭДТА, рН 8,0, чтобы лизировать клетки. Осторожно перемешивают вязкое содержимое пробирки и оставляют ее на 15 мин во льду. 4. Осколки клеток осаждают центрифугированием при 23000 д в течение 20 мин и при температуре 4'С 134 в пллзмиды (в роторе Вогча!! 88-34). Надосадочную жидкость декаитируют в 15-мл корексовую пробирку. 5.
Добавляют в пробирку 1 объем дистиллированной воды и 4 мкл раствора рибонуклеазы (1 мг/м,т). Смесь инкубируют 1 ч при 37'С, Дальнейшую очистку ДНК проводят так же, как и в методе с применением ДСН (равд. 15.1.3). 15.1.5. Выделение с помощью пенициллина Описываемая ниже методика может применяться для получения плазмидной ДНК грамположительных бактерий и таких грамотрицательных бактерий, которые устойчивы к тритону Х-100 н ДСН, но чувствительны к пенициллину. Если изучаемая бактерия образует 8-лактамазу, то эффективным может оказаться антибиотик, который устойчив к ферментам, расщепляющим пенициллин (например, цефалоспорин).
Мы не уверены в том, что такой же положительный результат дадут другие антимикробные агенты, активные в отношении биосинтеза клеточной стенки; эту возможность было бы полезно исследовать. 1. Вырашивают бактерии до середины логарифмической фазы роста, как описано в разд. 15.1.4. Добавляют пенициллин О из расчета 1 мг/мл и еще 2 ч инкубируют культуру при оптимальной для роста температуре. (Имеет смысл провести предварительные опыты, в которых следует определить время и концентрацию антибиотика, оптимальные для образования протопластов; целью при этом является максимальный выход прото- пластов при незначительном разрушении клеток. В данном случае может быть полезным добавление к ростовой среде 1 М сахарозы.) 2. Клетки, обработанные пенициллином, собирают центрифугированием, как и в предыдуших случаях, и дважды промывают их равнымн объемами 0,01 М трис- НС!, рН 8,2. 3.
Клеточный осадок суспеидируют в 0,25 объема 0,02 М триса, рН 8,2, 0,5 объема ! М сахаровы и 0,25 объема раствора лизоцима (4 мг/мл) в 0,02 М трнсе, рН 8,2, члсть пь гвннтикх 4. Инкубируют клеточную суспензню в течение 1 ч при 37'С на качалке. 5. Центрифугнруют ее прн 27000 и в течение 15 мин. 6. Осторожно суспендируют клетки в 0,02 М трисе, 0,01 М ЭДТА, рН 8,2, позаботившись о том, чтобы клетки в суспензии распределились равномерно. 7. Добавляют к суспензин 0,1 объема 10%-ного ДСН. Лизис должен завершаться в тсчение 10 мин.
Дальнейшие операции проводит так же, как в методе с применением ДСН (разд. 15.1.3). 15,2. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОИ ДНК С БОЛЬШОИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОИ' Предложенные выше методы имеют ограничение; они годятся только для тех плазмндных ДНК, молекулярная масса которых не превышает 100 10'.
В то же время для ряда бактериальных систем известнгя большие плазмиды, такие, как вызывающие образование опухолей растений плазмиды Ацгобас1егшт !ища[ос!епз [301, плазмиды, детерминирующие устойчивость к антибиотикам н относящиеся к группе несовместимости Н [!2), плазмиды Рзеиг(отолаз ри!Ыа, ответственные за разрушение камфоры [2, 241, а также разнообразные Е-факторы [22, 26, 27). В последнее время разработано несколько методов, позволяющих наряду с плазмидами небольшого размера выделять и эти большие плазмиды [9, 14, 17, 30).
Созданы также методы, дающие возможность работать с очень маленькими объемами или даже с материалом единственной колонии [1О). Метод, описываемый ниже, недавно разработали Портной н Уайт (личное сообщение). Его преимушество заключается в малых рабочих объемах; к тому же ему присущи лучшие стороны ранее опубликованных методик. В этом методе используется та особенность плазмидной ДНК, что ее цепи не расходятся под воздействием щелочи. Когда клетки разрушают в щелочных условиях, выход плазмидной ДНК с большой молекулярной массой (до 350 10') улучшается.
В настоящее время мы используем этот метод, ставший стандартным, для выявления плазмнд в любой культуре бактерий. 136 и плхзмнды Данный метод был успешно применен нами при выделении плазмнд как нз грамогрицательных бактерий (например, ЯдгоЬас(егшт йппе)ас(епз, Уегз(п(а еп(его- соИ(са, Ба(топеПа (урЫ, К(еЬз(еПа зр., Е, соЫ), так и нз грамположнтельпых (напрнмер, 5(арйу(ососсиз зр., н 5(гергососсиз зр.).
Как и при использовании других методов, мы заметили, что для морских вибрионов и для галофильных бактерий необходимы этапы промывки высококонцентрированными солевыми растворами (до 1 М ЖаС(). Плазмндная ДНК, полученная этим методом даже пз 2 мл культуры, практически не содержит хромосомной ДНК, и после проведения немногочисленных дополнительных этапов ее можно непосредственно использовать для анализа с помощью трех рестриктаз (равд. 15.3.1). Иеликом все операции метода с дополнениями проводят следующим образом. 1. Выращивают в течение ночи 2 мл культуры в соответствующей среде (например, в сердечно-мозговом бульоне) на качалке в пробирках высотой 120 мм с завинчивающимися крышками. Для последующей обработки используют выросшие клетки нлп получают из ннх популяцию в логарифмической фазе роста, для чего культуру разводят 1: 20 в 2 мл свежей среды н инкубируют ее дополнительно в течение 2 — 3 ч.
Клетки собирают цеитрифугированием в течение 1О мин в настольной центрифуге Вогчай при 2500 и. 2. Ресуспендируют клетки в 2 мл буфера ТЭ (0,05 М трис-НС!, 0,01 М ЭДТА, рН 8,0), повторяют центрнфугирование и тгцательно ресуспендируют клеточный осадок в 40 мкл буфера ТЭ. 3. Не ранее чем за сутки готовят лизирующий буфер (4% ДСН в буфере ТЭ, рН 12,4).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
