Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Важно точно измерить рН, так как при рН 12,5 происходит необратимая денатурация плазмидной ДНК. Наливают в 1,5-мл центрифужную пробирку (производятся фирмой ВПпйгпапп 1пз1гппзеп(з; помер по каталогу 22-36-911-1) 0,6 мл лизирующего буфера, после чего пастеровской пипеткой вносят туда же 40 мкл клеточной суспензии.
С,спензию хорошо перемешивают, не прибегая к помощи специальных перемешивающих устройств и избегая сильного взбалтывания. (Чтобы лишний раз не переносить кчль- 137 ЧАСТЬ ГН ГЕНЕТИКА туру, ее можно выращивать непосредственно в 1,5-мл центрифужной пробирке.) 4. Для полного ливиса клеток суспензию инкубируют в течение 20 мнн при 37'С. 5.
Нейтрализуют раствор добавлением 30 мкл 2,0 М гриса, рН 7,0. Перемешивают его, медленными движениями переворачивая пробирку до тех пор, пока не станет изменяться вязкость раствора. 8. Хромосомную ДНК осаждают внесением такого количества ЯаС! (около 0,24 мл 5 М (х)аС!), чтобы создать в растворе конечную концентрацию 1 М. Это делают очень быстро. Для полного осаждения хромосомной ДНК пробирку ставят в лед на 4 ч. Если обследуется большое число культур и не нужно заботиться об особой чистоте плазмид, это время можно сократить до 1 ч. 7.
С помощью микроцентрифуги (например, модель Еррепг(ог! 5412) за 10 мин осаждают посторонний материал и переливают надосадочную жидкость в другую 1,5-мл пробирку (не следует стараться, чтобы на дне первой пробирки осталось как можно меньше жидкости). 8. Для осаждения ДНК добавляют к надосадочной жидкости 0,55 мл изопропанола. После перемешнвання пробирку оставляют при — 20 "С на 30 мин. 9. ДНК осаждают центрифугированнсм в течение 3 мин на мнкроцентрнфуге, надосадочную жидкость выливают, пробирку в перевернутом положении ставят на бумажную салфетку и затем ее содержимое высушивают под вакуумом. 10. Осадок суспендируют в 30 мкл буфера ТЭН (0,05 М трис, 0,005 М ЭДТА, 0,05 М !х)аС1, рН 8,0). ДНК растворяется в течение ночи прп 4'С. Обычно при электрофорезе (100 В, 3 ч) !О мкл этого раствора в 0,7%-ной агарозе с применением трис-боратной буферной системы получают хорошо видимые полосы ДНК.
Для анализа плазмидиой ДНК рестрнктазным расщеплением ее подвергают дальнейшей очистке (равд. 15.3.2) на следующих дополнительных этапах. 11. Полученный на 9-м этапе осадок суспендируют в 100 мкл 0,01 М триса, рН 8,0, добавляют 100 мкл фе- и плхзмиды нала, насыщенного 0,01 М трисом, рН 8,0, хорошо перемешивают и добавляют 100 мкл хлороформа. 12. Разделяют водную и фенол-хлороформн1ю фазы центрифугированием в течеяие 30 с на микроцентрифуге.
Водную фазу отбирают 100-мкл микропипеткой, стараясь не захватить слой, находящийся между фазами. 13. Плазмидную ДНК осаждают двумя объемами 95$-ного охлажденного во льду этанола н дальше действуют, как на 9-м этапе, Полученный осадок растворяют в буфере для соответствующей рестриктазы. 15.3. ИЗУЧЕНИЕ СВОИСТВ ПЛЛЗМИДНОИ' ДНК 15.3.1. Электрофорез в геле Для выявления н предварительной характеристики ДНК плазмид, присутствующих в клиническом материале или лабораторных штаммах грамотрицательных и грамположительных бактерий, подходят обычные методы электрофореза в геле с незначительными модификациями 110, 23). Метод выделения плазмид с ДСН (разд. 15.1.3) широко применяется в сочетании с анализом ДНК гель-злектрофорезом 126). При этом, однако, в частично очищенных клеточных лизатах могут быть выявлены лишь те плазмиды, молекулярная масса которых лежит в пределах от 0,6 1О' до 100 10а.
Мы же используем метод, описанный в равд. 15.2, который позволяет выявлять плазмиды с мол. массой от 0,6.10' до 350 10'. При злектрофорезе плазмидной ДНК в геле расстояния, которые проходят разные виды молекул, находятся в обратной зависимости от значений их молекулярной массы. Во всех публикуемых в настоящее время методиках используются либо вертикальные, либо горизонтальные пластинки с гелем, регулируемые источники питания и источники коротковолнового ультрафиолетового света. Электрофорезу подвергают даже частично очищенные лизаты (как правило, достаточно 1О— 20 мкл).
Для электрофореза используют сгандартный прибор. в котором вертикально расположенная пластина с ге 139 часть иы гвнвтикй Рис. 15.1. Злектрофорез в агарозном геле неочищенных лизатов, полученных из разных штаммов бактерий [8). Образец ! (слева); стандартные плазмидные ДНК с варьированием по мол. массе от 62 1Оз (самая верхняя полоса) до 1,8 1О' (самая нижняя полоса).
Образцы 2 — 7: плазмиды, содержащвеся в разных бактериальных штампах. Хромосомная ДНК расположена в полосе, помеченной буквами Хр. лем (размеры геля 1ООХ140Х2,5 мм) имеет 12 лунок для нанесения проб (6,5Х15Х2,5 мм). Такой прибор можно купить (Ас(исЬонт1е Мас!!!нс апг) Вера!г 5)зор, Р. О. Вох 205, Ат(иеЬодцс, )ч"т'! 131) или изготовить в мастерских. Концентрация агарозы (тип Веа! егп МЕ, Маг!не Со))о!68, 1нс., 1(ос)с!апг), Ма!пе) в геле варьирует от 0,25 до 1,5о)о в стандартном буфере для электрофореза: 89 мМ трис, 2,5 мМ двунатриевая соль ЭДТА и 8,9 мМ борная кислота. Электрофорез проводят обычно !40 И ПЛАЗМИДЫ Таблица 15.1. Плазмнды, используемые в качестве стандартов молекулярной массы, и бактерии, служащие их источником Молекулярная масса плаамид.
,а днк ! щ'! Бактерия а 312 280 143 112 60 38 26 5,5 4,2 1,8 Рлеиг)отолаз аегийгаола РА02 (рМ0!) Р. пегий!ноиа РА02 (рМСг5) Еесlтенсага со!г' 13778 (ТР116) Е, сои 13Т41 (й27) 30!тапепа !ура!тиггинт 1.Т2 Р. пегий!пола РА02 (КР1) Е. сои К-12 35-3 (Яа) Е. сои К-12 %1485-1 (йбГ2124) Е. сои К-12%1485-1 (П5Р1610) Е. со1! )С411 (Со1Е1) Е. со!! %1485-! (РМВ8) а Этн штампы можно получить у Э. Ледероерг, р!аятпы !ег, Оераг!теп! о1 Мегиса! М!сгоьго!оау, 3!ап!ога бпгуегану Яап1ога, СА 94303 !!е!ерьопе 4!3732! — 2300). Ие!егепсе СепМеа!са! Зсьоо1, 141 в течение 2 ч при комнатной температуре, напряжении 120 В и силе тока 60 мА. Затем гель помещают в раствор бромистого этидия (0,4 — 1,0 мкг)мл) на 15 мип, после чего ДНК выявляют в дальнем ультрафиолете.
На рис. 15.1 показана фотография одного такого геля (0,7%-ная агароза). Полоса Хр соответствует хромосомной ДНК, находящейся в частично очищенном препарате. В первом образце кроме этой полосы имеется несколько полос, соответствующих плазмидной ДНК с разными, но известными молекулярными массами из различных штаммов бактерий; эти ДНК используются в качестве стандартов.
При построении графической зависимости в логарифмических координатах перемещения в геле плазмидной ДНК от молекулярной массы этой ДНК получают прямую линию в пределах от 100 10' до 1 !О'. Интерполяцией можно получить значения молекулярной массы плазмнд из различных бактерий. Для определения молекулярной массы неизвестных плазмид с помощью электрофореза в агарозном геле в качестве стандартов используют плазмиды, молекулярная масса которых известна (табл. 15.1). Чтобы выявить плазмиды с большой молекулярной массой, клетки лизируют по методу, описанному в разд. 15.2. Для удоб- ЧАСТЬ 11!.
ГЕНЕТИКА ства рекомендуется разделять раствор плазмидной ДНК, полученный для каждого из штаммов, на порции объемом по 20 мкл и хранить их при — 20'С. 15.3.2. Гель-электрофорез Рестриктаза катализирует расщепление двухцепочечной ДНК в специфических сайтах узнавания 11, 29), причем места расщепления в разных цепях смещены относительно друг друга.
В случае фермента Есо К!, например, специфическая нуклеотидная последовательность, которую он узнает, выглядит так: СААТТС СТТАА1з, где стрелки указывают места расщепления. Плазмидная ДНК (как и любая другая в этом отношении) после обработки эндонуклеазой дает характерный набор фрагментов, зависящий от числа н расположения в геноме специфических сайтов узнавания. Зги фрагменты разделяют электрофорезом в агарозном геле.
Сравнение картин разделения фрагментов, полученных из разных плазмид, позволяет качественно оценивать степень их родства. Фрагменты ДНК можно также перенести из агарозного геля на полоску нитроцеллюлозы (перенос материала из геля на бумагу называется блоттингом), а если провести их гибридизацию с радиоактивно меченным образцом ДНК, можно выявить фрагменты, содержапгие последовательности, гомологнчные последовательностям образца; гомологичные фрагменты выявляются прн радиоавгографин в виде резких полос на нитроцеллюлозной полоске [28). К настоящему времени описано около !50 различных рестриктаз; некоторые из иих производятся в промышленных масштабах (Ве!Ьсзба !(езеагсЬ 1 аЬога1огу, Коскт!!!е, М0 20850; М!!ез 1.аЬога1оПез, 1пс., Е)КЬаг1, 1!4 46514; !4еТЧ Епп!апд Вю!аЬз, Вечсг1у, Ма 01915). Для оптимального функционирования каждой рестриктазы нужны особые условия, которые обычно указываются )42 !5.
Пллзмиды Рис. 13.2. Наборы полос, получаемые прп обработке плазмид Лр' из разных энтеробактерий рестриктазод Н1пс 181. Обработку н электрофорез пронодпли. как описано в равд. 13 32, Гель окращивали броннстым этиднем. Картина люмняеспенпнн, возникающая в результате нитеркаляинп красителя при освещении ультрафиолетом, сфотографирована на плешсу «Поляроид».
изготовителем. Полезность анализа с применением рестриктаз мы проиллюстрнруем на следующем примерс. Кроза и др. [81 исследовали ряд устойчивых к ампициллипу гптаммов, относяшпхся к 1-му типу Япгдейа буьеп1ег1ае, которые были выделены во время разных эпидемий, Во всех случаях детерминанта устойчивости к ампициллину принадлежала плазмидс с мол.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
