Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 31
Текст из файла (страница 31)
4. На этой стадии следует иметь подготовленную к работе кювету и все необходимое для спуска раствора на поверхность. Маленькая пластмассовая чашка Петри (например, чашка диаметром 50 мм для культуры тканей) хороша в качестве кюветы, а для наклонного спуска раствора на водную поверхность можно использовать предметные стекла для микроскопа. Стекла должны быть отмыты сначала кислотой, а затем раствором детергента, после чего пх следует тщательно ополоснуть дистиллированной водой.
Кюветы ополаскивают гипофазой, которая состоит из смеси 45 мл 0,01 М трнс-НС1, 1,1 мМ ЭДТА, рН 8,5, и 5 мл 99%-ного формамида (Ма!11псгод1). Кювету наполняют гипофазой до образования выпуклого мениска. 5. Пользуясь чистым пинцетом, предметные стекла тщательно прополаскивают в растворе гипофазы и укрепляют нх под углом 30 — 45' у внутреннего края чашки. 6. Распыляют небольшое количество порошка талька тонкого помола на половину пути между местом нанесения раствора ДНК и нижним краем стекла. Тальк наносят с помощью пастеровской пипетки, один конец которой прикрыт бумажной тканью, а другой соединен с грушей. Можно также нанести тальк кисточкой из верблюжьей шерсти.
Порошок талька служит для определения границ монослоя во время растягивания пленки, к тому же он обеспечивает некоторое сжатие пленки, удерживая края монослоя. 7. Добавляют в 5-мл стакан разового использования 95 мкл раствора прошедшей отжиг ДНК и 5 мкл свеже- 1Я ПЛАЗМИДЫ приготовленного иа дистиллированной воде раствора (2 ыг/мл) цнтохрома с (Ь!цша, тип 11). Раствор ДНК с цитохромом с набирают с помощью какого-либо механического наборного устройства в пипетку с надетым на нее !00-мкл пластмассовым наконечником (его кончик должен быть отрезан).
8. Раствор ДНК с цптохромом с медленно выливают на предметное стекло на высоте около 0,5 см над водной поверхностью. Между наконечником пипетки и пшофазой на стекле постоянно должен быть перешеек жидкости. Стараются ие дышать над поверхностью и не двигать предметное стекло. Как только сформируется белковый монослой, тальк сразу же перемещается с предметного стекла к краям чашки. Если образуются завихрения, часть талька по кругу возврагцается обратно к стеклу, а пленка цнтохрома занимает область, свободную от талька. 9.
Через 1 мин после растягивания монослоя по поверхности берут пинцетом покрытую парлондем сетку и осторожно опускают ее парлодием вниз на монослой белка; после некоторой паузы поворачивают и поднимают сетку под углом 20 — 30'. В норме сетка должна быть покрыта большой плоской каплей. Таким способом готовят две — три сетки с монослоем из разных участков поверхности. 1О.
Окрашивают образец, погружая сетку в 5 10 — з М уранилацетат на 30 с. 11. Опускают сетку в изопентан на 10 с, чтобы облегчить высушивание. 12. Одно- и двухцепочечные участки ДНК должны быть видны в электронном микроскопе без натенения, но натененне позволяет лучше их различать. Закрепляют сетки на предметном стекле при помощи липкой с обеих сторон ленты и затем напыляют их при вращении под углом около 7', используя для этого 1,2-см отрезок платино-палладиевой (80: 20) проволоки 23-го размера (Тед Ре!!а, 1пс.) в вольфрамовой корзине (Е.
Р. Рп!!аш, 1пс.). Разрежение в камере нспарителя напыляющего аппарата перед напылением должно быть меньше б 10-' мм рт. ст. !3. Теперь сетки готовы к просмотру в электронном микроскопе. 20 разных гетеродуплексных молекул дают 16! чАсть !и. Гвиетнкк статистически надежные картины для измерения одно- и двухцепочечных участков. В качестве маркеров удобно использовать одноцепочечную ДНК фага ФХ и двухцепочечну>о ДНК.
Увеличение при электронной микроскопии можно откалибровать по стандартной выпускаемой промышленностью решетке (Тед Ре1!а, 1пс.). Длину ДНК на фотографических негативах измеряют при помощи увеличителшюго стенда (электронные планиметры фирм 1Чшпоп!с или Неск)е!1-Раскагд) нли навесных проекционных систем (фотоувеличитель). Иногда пользуются ручным курвиметром, но это более трудоемко. Рекомендичии по определени>о гомологии ДИК с помощь>о электронной микроскопии 1. Необходимо соблюдать чистоту.
Пристающие к поверхности вещества, такие, как детергенты, масляные пары и оставляемыи пальцами жир, мешают формированию монослоя и равномерному распределению белка. Не следует допускать загрязнения этими веществами оборудования, посуды или растворов. 2. Трис, уранилацетат, )к)а,-ЭДТА и нарлодпй нужно хранить в эксикаторе. Все реактивы должны быть химически чистыми. Перечисленные ниже растворы следует стерилизовать фильтрованием: 1 М трис, 0,1 М Нам ЭДТА, 1,8 М трис-НС1, 0,2 М трио, 0,1 М )к)аОН и 0,02 М )к)а,-ЭДТА.
Для приготовления исходного концентрированного раствора уранилацетата делают 5 10 ' М раствор уранилацетата в 10 мл 0,05 н. НС1 и стерилнзуют его фильтрованием. Для окрашивания концентрированный раствор разводят в 100 раз 90е/,-ным этанолом. Концентрированный раствор хранят только 1 нед, а разведенный раствор для окра>ниваиия — лишь в течение нескольких часов. 3. Формампд (НСО(к)Нз) гидролизустся с образованием формиата аммония, который в свою очередь дает аммиак и муравьиную кислоту. Г!роисходящие при этом изменения ионной силы в растворах верхней н нижней фаз могут приводить к неполному расправлепию одноцепочечной ДНК. Аммиак может испаряться, приводя к быстрому снижению рН.
Вследствие этого водные рас- 15 пллзмиды творы формамида следует использовать в первые 15 мин после смешивания. Формамид фирмы Ма!!!псгог)1 с 99е/о-ным содержанием можно использовать непосредственно без очистки; реактивы худшего качества предварительно должны очищаться, Чистоту реактива момсно определить измерением оптической плотности при 270 нм, которая должна быть (0,2. Очистку формамида проводят перекристаллизаггней следующим методом; оставляют формамид в запечатанной бутыли пли колбе при 0'С (запечатывание предотвращает поглощение воды) до тех пор, пока гггз — г!з его не закристаллизуется; кристаллы отделяют фильтрованием в холодной комнате нли центрифугированием при 0'С. 4. Растягнвание монослосв проводят в пластмассовых чашках Петри диаметром 50 мм.
Во время растягивания чашки фиксируют липкой лентой. 5. Предметные стекла моют и хранят в хромпике, а перед использованием тщательно промывают дистиллированной илп бпдистиллированной водой. После использования их ополаскивают водой и кладут опять в хромпик. 6. Для приготовления сеток, покрытых парлодисм, растворяют высушенный в сушильном шкафу прн 60'С парлодий (пироксилин, Ма!!!псгог)!) в нзоамилацетате или амилацетате до концентрации 5,5е)с. Для лучшего растворения смесь перемешивают, но не встряхивагот и затем добавляют в нее поглотители воды. Сетки покрывают парлодпем следующим образом. а) Помещают на подставку, лежащую на дне перекрытой воронки Бюхнера, решетку из стальной проволоки. Воронку наполняют бидистнллированной водой и укладывают сетки на эту решетку, Для обычной работы подходят медные сетки с размером ячейки 200 меш (Е.
Р. Рнпаш, 1пс.). Важно, чтобы все сетки были расположеаы одинаково: все либо матовой, либо блестящей стороной вверх. б) Очищают водную поверхность, добавляя несколько капель раствора парлодия и удаляя бумагой образовавшуюся пленку, после того как она высохнет. в) Получают пленку из одной капли раствора парлодня. 1!акрывают воронку оберточной бумагой Вагап и ждут около 3 мин, пока блестящая парлодиевая пленка пе образует у краев воронки широкие складки. Медленно спускают воду, чтобы пленка опустилась на сетки.
С задней стороны решетки, на которой лежат сетки, убирают избыток воды и кладут ее вместе с покрытыми парлодием сетками в сушильный шкаф с температурой 60 'С на 46 мин. Если пленка приготовлена правильно, она кажется серебристой. 163 ЧАСТЬ НК ГЕНЕТИКА 7. Приводим адреса некоторых поставщиков электронно-микроскопического оборудования и реактивов: Е. Р.
)гп!1апя, 1пс,, Р. О. Вох 444, 5СЬепес1ат)у, Ь)'!' 12301 (518/785-5533) Ь)игпоп1св, Р. О. Вох 444, )х)огй Юа!ев, РА 19454 (215/643-7410) Тет( Ре!!а, !пс., Р. О. Вох 510, Тивйп, СА 92680 (714/557-9434) 15.4. ЛИТЕРАТУРА 1. Воует Н. Ф'. Иез(г!сиоп апй птойи!саиоп о( ВЫА: епхутпе виЬз!гаЫв. Рет!. Ргос., 33, 1125 — 1127 (1974). 2. СааЬазагХу Л. М.
Р!азот!г(в 1п РяеитУотолая. Аппи. Йеч. Сепе1., 1О, 7 — 30 (1976). 3. С!ау!оп В. А., Вес!я Е. !р., 'ттлодтатз Х. Нолти!о8у апй з!гас!ига! ге!аиопзырв Ьепчееп ЬЬе й!тает!с апт) тпопотпег!с стгси!аг !остов о1 тпиосиопйпа! ВЫА !тоти Ьиптап 1есйепт!с !еи!сосу!ее. У. Мо1. В1о1., 47. 137 — 153 (1970). 4. С!еите1! В. В., Нейлзй В. Ат. 5иретсоиет) с)гси!аг В)ЧА-рго1е!п соптр1ех !и Езслет!сй!а сой: риг!Исаиоп апт( !присей сопчегйоп 1о ап орел с!гси1аг (опп. Ргос. Ыаи. Асей.
Яс(. 1).Б.А., 62, 1159 — 1166 (1969). 5. С!отвез Я. С. Мо!еси!аг в1гис1иге о( Ьас1епа) р!ампЫв. Вас1епо1. )!еч., 36, 361 — 405 (1972). 6. Стоял У. Н., Нтеллет В, У., Райоте 8. ()зе о1 а юп61екигапй вресгис пис)еаве 1ог апа!увтз о1 Ьас1епа! апй р!авпт!4 йеохупЬопис1е!с асЫ Ьотпо- апт) Ье1егойир1ехек Х. Вас(ег!о1., 115, 904 — 911 (1973). 7. Стоял У. Н., Х ииторр У.. К., Не//тол Р., Ра(Аозт 8. Та о терИсаиоп !пгиаиоп в1!ез оп И-р!азтпЫ ВЫА. Мо!.
Сеп. Сепе1., 140, 39 — 50 (1975) . 8. Стояа У. Н., О!атге У., Мати Е. У., йи(!терр Е. К., Релоталт)а М. Е. СЬвгас(епхаИоп о! а И-р!азптЫ аввоста(ей юй атпр)сиип гевм1апсе 1п ЮА!уеиа т(узел!ег!ае Фуре 1 !во!а!ей !тоти ерЫетп1св. АпиписгоЬ. Аееп!в СЬепго!Ьег., !1, 553 — 558 (1977). 9. СигНет 7. С., Нез!ет Е.
Ит. !во1аИоп о( сочв!епИу с1озед с)гси!аг ВЫА о( ЫИЬ гио1еси!аг ите18Ы 1тотп Ьас1епа, Апа1. В!осЬетп., 76, 43! — 441 (1976). 10. ЕсЫтатт(1 Т. А гарЫ гпериой (ог Иие ЫепЬИ)саИоп о1 р!аяп!4 т(еохуИЬопис!етс асЫ !и Ьас(ег!а, Р!автпЫ, 1, 584 — 588 (1978). 11, РтлАе!яХе!л М., !7оталт( Е. Н. А гарЫ тпеигот! !ог ех(гасили ВЫА 1готп аяагове ие!в. Р!авптЫ, 1, 557 — 562 (1978). 12. Вт!лтХ!еу Н. В. Р., НитлрЬгеуя В. О., Алт(етзол Е. Е. Мо1еси1аг в1ийез о1 И-1ас1ог сотираИЬ180у Итоирз. Х. Вас1ег!о!., 115, 387 — 398 (1973). 13 Яиегту Р.„ЕеВ!ало В. У., Ра!йоте Р. Сепега1 гпе(Ьот) !ог 1Ье Ыо!аИоп о( р!азтпЫ деохупЬопис1етс асЫ.
Х. Вас(ег!о)., 116, 1064 — 1066 (1973). 14. Налзел У. В., О!зел К. Н. 1во!аИоп о1 1агяе Ьас(ег(а! р1авптЫе апд !в. плазмиды сЬагас1епга!юп о1 Исе Р2 !псоспраНЫ!Иу игосср рЕавв!с(ь РМО! апд РМО5. Л. Вас(егсо1.. 135, 227 — 238 (1978). !5. НеуаяМ Р. П. Р!авпсЫ йе1епп(пес! гея!я1апсе !о апИЫоИсв: пю1еси1аг ргорегНев о1 П-Еас(ог.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
