Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 34
Текст из файла (страница 34)
Считается, что у средних спектрофотометров нулевая линия должна устанавливаться при 210 нм или при меньшей длине волны при ширине нте- 17б члсть ил мвтлволизм ли 2 мм. Если этого нельзя сделать, то следует проверить перечисленные выше факторы. Сравнение однолучевых и двухлучевых спектрофотометров Двухлучевые спектрофотометры сконструированы таким образом, что благодаря наличию в них двух пучков света они позволяют осуществлять одновременное илн параллельное сравнение интенсивностей !ю и /т', в одно- лучевых приборах эти два измерения проводят последовательно.
В двухлучевых спектрофотометрах пучок света разделяется так, что одна его часть проходит через раствор, используемый для установки прибора при /е= % Т= 100 или Аз=О, а другая — через образец для измерения % Т или Аь Для получения достоверных результатов необходимо, чтобы параллельные оптические системы и соответствующие электронные устройства работали идентично. Это осуществляется с помощью особых приспособлений, имеющихся сейчас во многих современных приборах. В однолучевых спектрофотометрах для достижения той же цели вначале устанавливают %Т=100 ил~ А=О для образца сравнения, а затем определяют %Т или А, помещая в пучок света измеряемый образец. Широко распространено мнение о том, что двухлучевые спектрофотомстры лучше, чем одполучевые. Часто считают, что однолучевые приборы недостаточно точны.
Это верно только в особых случаях. Двухлучевой спектрофотометр имеет преимущество, когда необходимо быстро снять спектр, а также когда источник света однолучевого прибора нестабилен или наблюдается быстрый дрейф нуля. Двухлучевые приборы очень удобны для прямой регистрации дифференциальных спектров. Однако пет никакой необходимости использовать их для отдельных измерений оптической плотностн, например при колоричстрическпх определениях и других обычных спектрофотометричсскпх измерениях. Регистрация спектров Спектры удобнее всего регистрировать с помощью двухлучевого спектрофотометра, снабженного самописцем.
В одну кювету помещают образец сравнения (ка- 170 иь физические методы кой-нибудь буферный раствор), а во вторую — измеряемый образец в том же растворителе. Чтобы повысить разрешение, устанавливают как можно более узкие щели и осуществляют сканирование при низкой скорости, При проведении важных экспериментов следует убедиться, что концентрация хромофора соответствует области линейных показаний прибора, что флуоресценцпя не мешает измерениям при высоких концентрациях хромофора (это проверяется с помощью флуориметра) н что прибор откалнброван по длинам волн.
Для определения спектра с помощью однолучевого спектрофотометра вручную устанавливают необходимые значения длин волн. Используя образец сравнения, прибор ставят па О при каждой длине волны и определяют оптичсскую плотность образца. Затем строят график, откладывая по оси х длину волны (в нанометрах), а по осн р значения А. Такой способ определения спектров, хотя и трудоемок, однако вполне приемлем для многих целей.
Определение концентрации веи1еств в растворах С помощью правильно откалиброванного спектрофотометра концентрацию растворенного вещества можно определить в стандартных кюветах с длиной оптического пути 1 см непосредственно по оптической плотности при определенной длине волны, если известен малярный коэффициент поглощения (е) этого вещества при данной длине волны; А/е (моль/л или ммоль/мл). Однако ни высококачественный спектрофотомстр, ни определение коэффициента поглощения не нужны в тех случаях, когда имеется чистое вещество, с помощью которого можно откалибровать даже колориметр, снабженный фильтрамн.
При этом получают стандартный график зависимости оптической плотности от концентрации для серии стандартных растворов, концентрацию вещества в которых можно измерить непосредственно или определить по цветной реакции. Графики показывают линейный диапазон н ошибки отдельных измерений. Можно применять стандартную статистическую обработку данных, т. е. определение воспроизводимости измерений, построение прямолинейных графиков методом наименьших квадратов, определение стандартного отклонения от 177 ЧАСТЬ Ил МЕТАБОЛИЗМ среднего значения н сгандартной ошибки.
Хотя линейность — это весьма желательное условие, можно использовать также и нелинейную хорошо воспроизводимую калибровочную кривую, находя величины прямо из графика. Определение концентрации частиц [61 Фотометрическое определение концентрации частиц в суспензии зависит от степени ослабления светового пучка в результате рассеяния света.
В предназначенном для такого определения нефеломегре имеется высокочувствительный фотомстр с фотодетектором, располо. женным под углом 90 — 160' к падающему световому пучку. Фотометрическнй сигнал не подчиняется закону Ламберта — Бэра, тем не менее при очень низких концентрациях частиц, которые можно измерить с помощью нефелометра, но не фотометра, измеряющего пропускание, сигнал бывает почти линейным. Для измерения более высоких концентраций частиц можно также использовать спектрофотометры и колориметры, но такой метод основан на определении ослабления падающего светового пучка.
В приборах обоих типов получают калибровочную кривую зависимости сигнала от концепграцпи бактериальных клеток (см. равд. 11.4). Определение скоростей реакций Если реагирующее вещество или продукт реакции представляет собой хромофор, скорость его потребления или образования можно определить, измеряя оптическую плотность при фиксированной длине волны через те нлн иные промежутки времени или следя за изменением поглощения во времени с помощью самописца.
Гкорость реакции можно определить по наклону кривой зависимости оптической плотности от времени. Для этой цели разработаны специальные спектрофотометры и приставки к стандартным спектрофогометрам. Некоторые из них, специально предназначенные для определенна скоростей реакций, катализируемых ферментами, регистрируют величины оптической плотности непосредственно на бумаге самописца, что дает возможность следить одновременно за протеканием нескольких реакций. 1тз 1б Физические методы 16.1.2. Флуориметрия Флуоресценцпя — это пснускат!е света флуорофором, который поглощает свет при меньшей длине волны. Поскольку измерение основано на сравнении энергии излучения в измеряемой пробе с очень низким уровнем излучения в контрольном образце, отношение сигнала к шуму очень высоко и, следовательно, флуориметрические измерения более чувствительны, чем абсорбцнонные.
Например, определение МАВН, основанное па флуоресценции, приблизительно в 100 раз чувствительнее, чем спектрофотометрический метод. Интенсивность флуоресценции зависит как от концентрации флуорофора, так и (в отличие от поглощения) от интенсивности возбуждающего излучения. Поскольку возбуждение и излучение флуоресценции возника!от при различных длинах волн, прибор должен быть устроен так, чтобы энергия возбуждения не доходила до фотодетектора.
Это обычно достигается путем помещения детектора под углом 90' к световому пучку, возбуждающему излучение. Светорассеяние как в растворе, так и от поверхности может создавать большие трудности, но его можно свести к минимуму с помощью граничных фильтров с «крутым» фронтом, пропускающих энергию флуоресценции, но задерживающих энергию возбуждения. Поскольку интенсивность флуоресценции зависит от интенсивности возбуждающего света, первостепенное значение имеют характеристики излучения лампы и стабильность ее работы.
В некоторых приборах интенсивность возбуждающего света регулируется с помощью второго фотодетектора, прп этом определяется отношение интенсивности флуоресценции к интенсивности возбуждающего света. При низких интенсивностях флуоресцентного излучения выходное напряжение фотодетектора почти линейно зависит от интенсивности, следовательно, концентрация флуорофора пропорциональна эквивале!пу пропускания', а не оптической плотности, как прп абсорбционной фотометрни.
Концентрацию фл)орофора можно опреде- и Интенспнность флуоресценцпп пропорциональна поглощению образца 11 — Т), а не пропуснанпю (Т) — Прим. ред !79 ЧАСть ИЛ МЕТАБОЛИЗМ лить, измеряя относительную флуоресценцию. Определе. пие заключается в основном в приготовлении контрольного растворителя и набора стандартных растворов, построении стандартной кривой и сравнении с неизвестными образцами. Поскольку чувствительность этого метода выше, вероятность влияния артефактов на результаты измерения больше, чем при абсорбционной фотометрии.
Нестабильность прибора Необходимо проверять или предотвращать флуктуации возбуждающего света, возникающие из-за нестабильности лампы. Могут оказаться необходимыми частые повторные измерения чистого растворителя и стандартов. Поглосцение растворов Высокая оптическая плотность растворов приводит к ошибкам двух типов: 1) реабсорбции энергии флуоресценции, заметно снижающей выход флуоресценции, и 2) неодинаковой интенсивности иа передней излучающей поверхности в приборах, в которых регистрация производится под прямым углом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
