Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Ионообменные смолы Существует много синтетических смол с различным числом поперечных связей (сшивок). Более низкая степень поперечного связывания приводит к повышению проницаемости ионообменных смол и увеличению их набухания в воде, а также к появлению у них способности взаимодействовать с молекулами ббльших размеров.
Обменная емкость, отнесенная к объему набухших частиц, и селективность ионообменннка повышаются пропорционально числу поперечных сшивок н обратно пропорционально размерам частиц. Таким образом, мелкозернистые ионообменники обладают более высокой разрешающей способностью просто благодаря увеличению числа вовлеченных в разделение веществ обменных циклов.
Однако более плотная упаковка малых частиц вызывает уменьшение скорости потока, что в свою очередь требует повышения рабочего давления. Сорбция, очистка и фракционирование веществ — это основные процессы, для осуществления которых используются ионообменники. При сорбции нужный ион избирательно отделяется от остального материала. При очистке тот или иной ион избирательно сорбируется и затем избирательно элюируется, тогда как все остальные ионы либо не сорбируются, либо задерживаются на ионообменнике. Фракционирование представляет собой 192 1б.
<Ризические методы процесс разделения нескольких одипаково заряженных зонов с помощью систем растворитель — растворенное вещество, которые производят последовательное элюироваиие ионов с постепенно повышающейся величиной заряда. Чисто эмпирическим путем установлено, что разрешающая способность хроматографического слоя зависит от его длины, а обмепиая емкость при данном разрешеиии — от площади поперечиого сечения слоя. Поскольку связывание попов из раствора носит стехиометрический и обратимый характер, необходимое количество смолы можно рассчитать, если известна ее емкость.
Как правило, прочность связывания иеоргапических ионов прямо пропорциональна их валентности (числу зарядов) и обратно пропорциональна атомному номеру. У слабых кислот и осповаиий прочность связывания зависит от рК иоиизируемой группы, если значения рН в данном эксперименте лежат в интервале ее диссоциации. Обменные прогивоионы и деионизация Поскольку иоиообмепиики заряжены противоиоиом (иапримср, для дауэкса-1 это может быть ОН-, С1, формиат и т. д.), можно практически полностью обменять иои из раствора иа заряженный противоиои.
Так, хлорид можно обменять иа ОН при использовании дауэкса-1, а НР— иа НаР в случае дауэкса-50. Поэтому основное примеисиие иоиообмсиииков — это деиоиизация незаряженных растворепиых веществ. Деиоиизаци1о можно осуществлять путем пропускаиия раствора через катиоио- и аииоиообмеипикп или через их смешанный слой, который, правда, трудно регенерировать и обычно приходится выбрасывать. При деиоиизации углеводов незаряженные сахара могут вести себя как слабые кислоты и сорбироваться сильными аииопообмеиииками. Для этих целей следует применять слабый основиой вопообмеииик.
При иоипом обмене соблюдается иерархия в сродстве ионов. Поэтому трудно осуществить прямое замещеиие иона с высоким сродством иа иои с низким сродством. Например, иецслесообразпо пытаться превратить 193 пасть ил мвтАголизм дауэкс-1 — С! в дауэкс-! — формиат одним лип!ь промыванием муравьиной кислотой или формиатом натрия.
Более эффективный способ состоит в переводе хлоридной формы в гидроксильную, а затем гидроксильной— в формиатную. Данные о степени сродства ионов приводятся в брошюрах, выпускаемых фирмами, или в справочниках. Концентрирование Благодаря высокому сродству тех или иных ионов к иопообмепнику их можно сорбировать на нем из большого объема разбавленного раствора путем пропускания пробы через колонку, заполненную этим ионообменником.
Сорбированные ионы можно затем выде. лить в небольшом объеме элюата, содержащего ионы, имеющие более высокое сродство к ионообменнику или более высокую концентрацию. Таким способом выделяют для анализа обычные и редкие неорганические элементы, а также радиоизотопы и следовые количества органических соединений. Очистка и фракционированае Если два иона обладают различным сродством к ионообменнику при данном значении рН, то, чтобы осуществить их разделение, подбирают условия, при которых происходит элюированис только какого-нибудь одного из этих ионов. В подобных исключительных случаях паб.чюдается «фронтальное» элюнрование каждого иона.
В тех же случаях, когда сродство ионов одинаково, их разделение все же возможно, если найти условия, при которых ионы элюируются избирательно. Пропусканне элюентов в этих условиях через колонку приводит к последовательному элюировапию ионов, в результате чего они могут разделиться, если колонка имеет достаточную длину. Однако диффузия ионов ограничивает разрешающую способность колонки и в этом случае.
При изменении рН или ионной силы происходит элюирование сорбироваиных ионов с различными значениями рК или возрастающим сродством. гб. Физические методы Градиентная элюция Элюирование сорбированных молекул путем непрерывного изменения состава элюента — это полезный прием, позволяющий максимально повысить разделительную способность хроматографнческой системы. Вместо ступенчатого изменения концентрации раствора с помощью различных элюснтов осуществляют ее непре- Рис.
16.5. Система для создания линейного градиента. Плошали поверхностей химических стаканов 1 и 3 раним. 3 — стержень лля раамешивания, 4 — магнитная мешалка. рывное изменение в заданных пределах. Используемые при этом методики и оборудование могут быть самыми разнообразными — от очень сложных, как в случае девятикамерного прибора для элюировання, применяемого при разделении аминокислот на смоле дауэкс-50 (гча+), до относительно простого устройства для создания линейного градиента путем смешивания двух компонентов. В последние годы при хроматографии чаще всего используют простой линейный градиент. Для этой цели два сосуда 1'461 соединяют между собой посредством сифона (рнс.
16.5) и один из них (смеситель) присоединяют к колонке. С помощью мешалки, которой снабжен смеситель, поддерживается однородный состав элюента. Если оба сосуда сообщаются с атмосферой и Имеют одинаковую площадь поперечного сечения, состав элюента изменяется линейно от состава раствора в смесителе до его состава в резервуаре. Крутизна граднснтз зависит от объема растворов, содержащихся в обоих сосудах. Предположим, что необходимо создать такой градиент, чтобы можно было собрать 25 фракций объемом )О мл, в которых концентрация соли возрастает линей* 195 ЧАСТЬ и МЕТАБОЛИЗМ но от 0,01 М калийфосфатного буфера (рН 7) до 0,01 М фосфата (рН 7) +0,01 М КС1. Общий объем, необходимый для создания градиента, равен 250 мл.
Прежде всего берут два химических стакана на 250 мл, которые устанавливают так, чтобы их можно было соединить П-образной стеклянной трубкой (рис. 16.5), или используют химические стаканы, один из которых (резервуар) имеет внизу одно выходное отверстие, а другой (смеси- тель) — два. Смсситель помещают на магнитную мешалку и соединяют выходное отверстие посредством трубки с колонкой. В резервуар добавляют 125 мл фосфатного буфера+КС!, а в смеситель — 125 мл того же фосфатного буфера без КС1. Независимо от этой установки через колонку пропускают сверху некоторое количество 0,01 М фосфатного буфера для уравновешивания системы исходным элюентом.
Затем начинают элюирование, пропуская через колонку раствор из смесителя. Элюирование продолжают при перемешивании до тех пор, пока все содержимое сосудов не перетечет в колонку.. Линейность градиента проверяют, определяя во фракциях количество хлорида.
Необходимо предотвратить перемешиаание содержимого двух сосудов до начала элюирования, поэтому входное и выходное отверстия в смесителе должны быть снабжены зажимами. Если отношение площади попере ного сечения резервуара к площади поперечного сечения смесителя больше 1, то градиент будет «выпуклымз, а если меньше 1, то «вогнутым», согласно уравнению С = С,— Р(1 — о)я~l"А где Сз — концентрация раствора в смесителе (нижний уровень), С~ — концентрация раствора в резервуаре (верхний уровень), Р— разность между этими ко1шентрациями, о — доля первоначального объема, вытекшего из сосуда к данному моменту времени, а А~ и Аз — площади поперечного сечения сосуда, содержащего раствор с более высокой концентрацией, и сосуда, в котором происходит смешивание растворов, соответственно. Следует отметить, что при обычном методе создания градиентов, когда элюент с более высокой концентрацией по каплям добавляется из целительной воронки в смеситель, содержащий раствор с постоянным объ- 196 га Физические методы емом, получаются выпуклые градиенты, которые дают недостаточно хорошие результаты.
Более сложные градиенты можно создавать, используя несколько расположенных в ряд сосудов, причем смешивание растворов происходит только в последнем. В каждом из сосудов могут быть разные элюенты, что и приводит к получению сложного градиента. Для этой цели создано градиентное устройство из девяти камер !481. Нуклеиновые кислоты Для разделения пуклеотидов, нуклеозидов, пуриновых и пиримидиновых оснований используют анионо- и катиопообменники с низкой степенью сшивкн. При этом осуществляется строгий контроль ионной силы, рН и не- ионного связывания.
5'-нуклеотиды разделяют с помощью дауэкса-5044/-Х4 (0отч СЬеппса! Со.) или АС450%-Х4 (В!о-Ка4! 1.аЬога!оНез). Пробы в 0,1 — 1 мл злюнрующего буфера наносят на колонку длиной 40 см н элюируют 0,1 М формиатом аммония с рН, доведенным до 3,2 муравьиной кислотой, со скоростью 1 мл/мин. Для разделения 2'- и 3'-нуклеотндов используют колонку длиной 85 см, а в качестве элюирующего буферного раствора 0,25 М формиат аммония с рН, доведенным до 4,1 муравьиной кислотой !ЗЗ). В другой системе, в которой для контроля ненонного связывания применяют градиент соли и этанол, рибо- н дезокснрнбоолигон> клеотиды разделяются в зависимости от нуклеотидного состава, длины цепи и наличия 3'- или 5'-концевых фосфатных групп 131!.
По одной методике используют колонку размером 60ХО,З см с АС1-Х2 (400 меш, В!о-Ка41 ! аЬО- га!оПез). Разделение проводят со скоростью 12 мл/ч, используя для элюции 400 мл 20% -ного этанола, содержащего линейный градиент 0 — 1,0 М ЫН4С! (рН 10). По второй методике в колонке !ОООО,2 см с дауэксом 1-Х4 (400 меш) применяется следующая программа введения пробы и элюировання: 0,4 мл 1 М НЕОН, 1 мл 20%Гиого этанола, по 1 мл воды и пробы, 1 мл 20%-ного этанола, после чего через колонку пропускают 200 мл этапола, содержащего линейный градиент 0 — 0,5 М Ь)Н4С1 (рН 10), со скоростью 6 — 10 мл/ч. 197 ЧАСТЬ !Ч МЕТАБОЛИЗМ Циклические нуклеотиды в гомогенизированной, депротеинизированной и нейтрализованной пробе разделяют на колонке размером 0,5Х4 см со смолой ЛП1-Х8 в формиатной форме (200 — 400 меш), уравновешенной 0,1 н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
