Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 40
Текст из файла (страница 40)
207 ЧАСТЬ ПЛ МЕТАБОЛИЗМ Приборы Хотя существует большое разнообразие сложных приборов, предназначенных для ГЖХ, чтобы получить удовлетворительные результаты, достаточно иметь блок с обогреваемым входом для введения проб, термостатом для одной или двух колонок, позволяющим осуществлять контролируемое повышение температуры, обогреваемым детектором, регулятором потока газа и самописцем. Удобно также иметь оборудование для охлаждеиия термостата, позволяющее сократить время между анализами. Из нескольких типов существующих детекторов два оказались особенно полезными для микробиологических исследований.
Детектор, регистрирующий соединения по их теплопроводности, очень удобен для анализа газов, например газов, выделяемых бактериями. Ри состоит из нагреваемой электричеством нити, сопротивление которой в основном линейно зависит от температуры. Перенос тепла иа чистый газ-носитель и иа его смеси с анализируемыми газами измеряется с помощью моста Уитстона. Детектор обладает средней чувствительностью, а линейность показаний сохраняется в диапазоне концентраций, крайние значения которых различаются между собой в 104 раза. Пламенно-ионизацион ный детектор — это устройство, в котором создается водородно-кислородное пламя для сжигания в нем анализируемых органических веществ, содержащихся в выходящем из колонки газе.
Образующиеся при этом ионы и электроны, проходя через пространство между заряженными электродами, приводяг к увеличению силы тока. Ток обнаруживают с помощью электрометра. Детектор такого типа нечувствителен к перманентным газам и воде и очень чувствителен к скорости потока массы (1 — 10 пг~с). Детектируемые количества вещества определяют путем умножения чувствительности на ширину пика. Существуют детекторы и других типов.
Одни из них специфичны для одного-единственного элемента, другие же регистрируют какой-то один класс молекул, ие реагируя иа молекулы других классов. Электронозахватный детектор, например, чрезвычайно чувствителен к об- и Физические методы наружению структур, способных захватывать медленные электроны (например, алкилгалогениды, сопряженные карбонильные группы, нитраты и т. д.), но не реагирует на углеводороды, спирты, кетоны и другие соединения, не захватывающие электроны (25].
Подготовка пробы и получение химических производных Анализ биологических жидкостей, клеточных экстрактов и других сложных материалов с помощью ГЖХ может оказаться невозможным из-за присутствия высокополярных и высокореактивных компонентов или ряда мешающих примесей. Кроме того, такие неочищенные пробы могут преждевременно загрязнять жидкую фазу. Поэтому обычно проводят предварительное разделение анализируемой смеси для удаления из нее микроорганизмов, компонентов культуральной среды, белков, смол, солей и т.
д. Иногда перегнанные или проэкстрагированные пробы можно вводить прямо в колонку. При этом, однако, следует иметь в виду, что данный метод неприменим к водным пробам. В некоторых случаях требуется высушивание, гидролиз или количественная химическая обработка проб для получения летучих производных. Эти процедуры часто являются причинами дополнительных ошибок.
Содержащиеся в пробах вещества с недостаточной летучестью в рабочем диапазоне температурьп необходимо подвергнуть модификации. Это может быть превращение сахаров в триметилсилиловые эфиры, получение метилгликозидов (с помощью метанолиза) полисахаридов и сахарсодержащих гетерополимеров, метиловых эфиров жирных кислот (за исключением короткоцепочечных) и метиловых эфиров Ы-ацильных производных аминокислот и пептидов, а также образование других производных. Описание специальных методик следует искать в работах, приведенных в списке литературы, а также в других публикациях, где описан анализ веществ, требующих модификации.
чксть ш.мвткволйзм Факторы, влияющие на разделение Колонка. Разрешающая способность колонки возрастает пропорционально корню квадратному из длины разделяющего слоя, а время злюирования линейно зависит от длины этого слоя. Емкость пропорциональна поперечному сечению насадки. Для набивных колонок их длина ограничена максимальным рабочим давлением и вместимостью термостата. Длина капиллярных ко. онок со слоем неподвижной фазы, нанесенным на их внутренние стенки, ограничена в меньшей степени. Эти колонки могут быть намного длиннее. В большинстве случаев пригодны П-образные или спиральные колонки длиной 2 — 3 м и внутренним диаметром 2,5 мм, изготовленные из стекла или нержавеющей стали. Газ-носитель.
Для проведения быстрого анализа пробы при высоких скоростях потока, когда происходит быстрая диффузия компонентов пробы, используют водород и гелий. Х~ применяют для приближения к состоянию равновесия между фазами при более низких скоростях потока. Повышение плотности сводит к минимуму диффузию растворенных веществ в газовой фазе. Температура. Понижение температуры улучшает разделение, а ее повышение сокращает время анализа. Выбор температуры должен быть основан на компромиссном решении, принятом с учетом этих факторов. Жидкая фаза и материал носителя Хотя четких правил для выбора жидкой фазы не существует, ои определяется до некоторой степени характером растворимости исследуемых веществ. Иными словами, для хроматографии полярных веществ используются полярные растворители, и наоборот.
Таким образом, полярные вещества элюируются быстрее п случае применения неполярной жидкой фазы. При разделении гомологов элюирование происходит в соответствии с их температурами кипения. Если перед исследователем не стоят какие-то особые задачи, требующие подбора подходящего материала для набивки колонки, более целесообразно воспользоваться адекватной системой, описанной в литературе.
ав и ьизичяския методы Анализ бактерий на содержание углеводов Применяемые для этой цели методики исходят нз общих методов анализа углеводов [491, гликосфинголинидов [43] и гликоцротеинов [471. Сахара, связанные гликозидными связями, освобождаются путем метанолиза с выделением О-метилгликозидов, и все свободные сахара также превращаются в метилгликозиды тем же способом. При метанолизе гликозидных связей происходит изменение конфигурации молекулы, однако при этом образуется только один аномер.
Из свободных сахаров образуется больше одного аномера, так как в растворе присутствует смесь аномеров. Собранные и отмытые клетки (около 100 мг сухой биомассы) инкубнруют в закрытых пробками пробирках с 2 мкл 4 н. метанольной НС1 (раствор газообразной НС1 в метаноле) нри 75'С в течение 4 ч или 0,5 н. метанольной НС! при 95'С в течение 24 ч. Высушенный гидролизат ресуспендируют в метаноле и высушивают несколько раз для удаления НС!.
Осадок растворяют в 1 — 2 мл сухого ниридина, переносят в маленькую коническую пробирку и добавляют 0,2 мл гексаметилдисилазана и 0,1 мл триметилхлорсилана. Смесь встряхивают в течение 30 с н оставляют на ночь при комнатной температуре. Суспензию центрифугируют, переносят надосадочную жидкость в чистую пробирку и высушивают при 55 С в токе Хь Осадок экстрагируют 10 мл гексана и экстракт унаривают до 0,25 мл. Пробы анализируют в газовом хроматографе нри следуюгцих условиях: температура дозатора 245'С, температура детектора 250'С, газ-носитель Им ненолярная колонка с Зе/е-ным ОЪ'-1 на газ-храме Я (60 — 80 меш), размеры колонки 1,8 мХ2,5 мм, температура термостата в течение 5 мин поддерживается нри 120'С, после чего ее постепенно повышают до 200'С со скоростью 5'С за 1 мин.
Можно использовать также полярную колонку с 15те-иым карбоваксом (20 М, 60 — 80 меш), нанесенным на промытый кислотой хромосорб % при 120 'С. С успехом применяются и некоторые другие методики [34, 35, 37, 38, 41, 5! ). См. также разд, 17.2. часть ил мятлволизм Кислоты — промежуточные или конечные продукты метаболизма (см. также равд. 16.3.1 и 18.5.2) Кислоты, образующиеся в цикле трикарбоновых кислот и в реакциях других метаболнческих путей, такие, как молочная, лимонная, изолимонная, яблочная, янтарная, цис-аконитовая, фумаровая, пировиноградная, щавелевоуксуспая и глиоксиловая, количественно определяют в виде метиловых и триметилсилиловых эфиров.
В статье Элкока [29) рассматриваются особые трудности, встречающиеся при анализе некоторых из таких кислот, например ненасыщенных жирных кислот и кетокислот. Хотя имеется подробное описание нескольких методик, в них используются только аутентичные пробы кислот. Экстракцию же кислот из биологического материала осуществить трудно. Описываемая ниже процедура, основанная на методике Элкока [29~, успешно применяется для количественного определения кислот, образуемых бактериями и присутствующих в реакционных смесях, Кислотность пробы объемом 25 мл доводяг до рН 2 с помощью серпой кислоты, затем добавляют известное количество маргариновой (гептадекановой) кислоты в качестве внутреннего стандарта и раствор высушивают. К сухому остатку добавляюг 5 мл реактива метанол— фторид бора (Арр11еб 5с(епсе 1.аЬога1огу, 5(а1е СоПеде, Ра.) и смесь количественно переносят в центрифужную пробирку на 50 мл.
Суспензию центрифугируют и осадок дважды промывают небольшим количеством реактива метанол — трифторид бора, надосадочные жидкости объединяют и оставляют на ночь. Раствор разбавляют равным объемом воды и экстрагиру|от трижды 2 мл хлороформа. Слой хлороформа удаляют, экстракты объединяют и избыток хлороформа отгоняют в токе сухого азота. Хроматографирование можно проводить на 5е)ч-ном диэтиленгликольадипате, нанесенном на очищенный [29) хромосорб % (30 — 60 меш; длина колонки 244 см, ннутренннй диаметр 0,64 см), при скорости потока гелия 45 мл/мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
